S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Dyakov
Wprowadzenie
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary - czynnik wywołujący zarazę zarazy, najważniejszą gospodarczo chorobę ziemniaków i pomidorów - od ponad półtora wieku przyciąga szczególną uwagę naukowców z różnych krajów. Pojawiając się nagle w Europie w połowie XIX wieku, spowodował epidemię ziemniaków, która pozostała w pamięci wielu pokoleń.
Do tej pory często nazywany jest „grzybem irlandzkiego głodu”. Niemal sto lat po pierwszych epidemiach odkryto dzikie meksykańskie gatunki ziemniaków odporne na zarazę późną, opracowano metody ich krzyżowania z ziemniakami uprawnymi (Muller 1935) i uzyskano pierwsze odmiany odporne na zarazę późną (Pushkarev, 1937). Jednak wkrótce po rozpoczęciu ich komercyjnej uprawy nagromadziły się rasy patogenu zarazy późnej, które były zjadliwe w stosunku do odmian odpornych. a wprowadzenie nowych genów odporności z dzikich meksykańskich ziemniaków do odmian zaczęło szybko tracić na skuteczności.
Niepowodzenia w stosowaniu oporności monogenicznej (pionowej) zmusiły hodowców do poszukiwania bardziej złożonych sposobów wykorzystania niespecyficznej odporności poligenicznej (poziomej). W ostatnich latach w poszczególnych populacjach pasożyta zaczęły się kumulować wysoce agresywne rasy, powodując erozję nawet niespecyficznej odporności. Pojawienie się szczepów odpornych na fungicydy spowodowało problemy w stosowaniu środków ochrony ziemniaków.
Ze względu na znaczne różnice między lęgniowcami a grzybami w składzie chemicznym, ultrastrukturze i metabolizmie, fungicydy, zwłaszcza ogólnoustrojowe, stosowane do ochrony roślin przed wieloma chorobami grzybiczymi, są nieskuteczne przeciwko lęgniowcom.
Dlatego w ochronie chemicznej przed zarazą zarazy stosowano wielokrotne (do 12 razy w sezonie lub więcej) opryskiwanie preparatami kontaktowymi o szerokim spektrum działania. Rewolucyjnym krokiem było zastosowanie fenyloamidów, które są toksyczne dla lęgniowców i rozprzestrzeniają się ogólnoustrojowo w roślinach. Jednak ich powszechne stosowanie szybko doprowadziło do nagromadzenia się opornych szczepów w populacjach grzybów (Davidse et al., 1981), co znacznie skomplikowało ochronę roślin. P. infestans jest praktycznie jedynym pasożytem strefy umiarkowanej, którego szkód w rolnictwie ekologicznym nie można zneutralizować bez zastosowania chemicznych środków ochrony (Van Bruggen, 1995).
Powyższe wyjaśnia ogromną wagę, jaką naukowcy z różnych krajów przywiązują do badań populacji P. infestans, dynamiki ich liczebności i składu genetycznego, a także genetycznych mechanizmów zmienności.
Cykl życia R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans rozwija międzykomórkową grzybnię z haustoria wewnątrz liści ziemniaka. Żerując na tkankach liści, powoduje powstawanie ciemnych plam, które w deszczowe dni stają się czarne i gniją. Po silnej porażce cały liść umiera. Po okresie żerowania na grzybni tworzą się odrosty - sporangiofory - które wyrastają na zewnątrz przez aparaty szparkowe. W deszczową pogodę tworzą biały kwiat wokół plam na spodniej stronie liści. Na końcach sporangioforów tworzą się zoosporangie w kształcie cytryny, które odrywają się i są przenoszone przez deszcz (ryc. 1). Spadając w kropelki wody na powierzchni liścia ziemniaka, zarodnie kiełkują z 6-8 zoosporami, które po pewnym okresie ruchu są zaokrąglone, przykryte skorupą i kiełkujące rurką na kiełki. Kiełek przenika przez aparaty szparkowe do tkanki liścia. W pewnych warunkach zarodnie mogą rosnąć w probówce bezpośrednio w tkance liścia. W sprzyjających warunkach czas od zakażenia do powstania nowej zarodnikowania wynosi tylko 3-4 dni.
Na ziemi i przefiltrowaniu przez glebę zarodnie mogą infekować bulwy. Ciężko porażone bulwy gniją podczas przechowywania; u osób słabo dotkniętych infekcja może utrzymywać się do następnego sezonu. Ponadto czynnik wywołujący zarazę może utrzymywać się zimą w postaci oospor (grubościennych spoczynkowych zarodników płciowych) w glebie na szczątkach roślin i na nasionach pomidora. Oospory powstają na żywych organach roślin, gdy szczepy różnych typów godowych spotykają się z nadmierną wilgocią. Wiosną na zasadzonych porażonych bulwach i resztkach roślinnych z oosporami tworzy się bezpłciowa sporulacja; zoospory wnikają do gleby i powodują infekcję dolnych liści roślin. W niektórych przypadkach grzybnia może rosnąć od zakażonej bulwy do zielonej części rośliny i zwykle pojawia się w górnej części łodygi.
Istotna różnica między lęgniowcami a większością grzybów polega na przewadze diplofazy w ich cyklu życiowym z mejozą gametową i kiełkowaniem zygot (oospor) bez redukcyjnego rozszczepienia jądra. Ta cecha, w połączeniu z dipolarnym heterotalizmem, zastępującym biseksualność, wydaje się umożliwiać zastosowanie do lęgniowców podejść opracowanych do badania populacji wyższych eukariontów (analiza panmixii i podział populacji, wewnątrz- i międzypopulacyjne przepływy genów itp.). Jednak trzy czynniki nie pozwalają na całkowite przeniesienie tych podejść w badaniach populacji P. infestans.
1. Wraz z oosporami hybrydowymi w populacjach tworzą się samozapłodnione i partenogenetyczne oospory (Fife i Shaw, 1992; Anikina i in., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003), a częstotliwość ich powstawania może być wystarczająca do na wynikach testów.
2. Proces płciowy u P. infestans ma niewielki wpływ na dynamikę liczebności populacji, ponieważ grzyb rozmnaża się głównie przez zarodniki wegetatywne, stanowiąc ponad 90% wyników analizy typu krycia metodą tradycyjną na pożywce ... w okresie wegetacji kilka pokoleń bezpłciowej sporulacji (rozwój choroby policyklicznej). Oospory odgrywają ważną rolę w zachowaniu organizmu w okresie braku roślin zielonych (zimą) oraz w pierwotnej infekcji sadzonek. Następnie w okresie letnim następuje rozmnażanie klonalne i wzrost lub odwrotnie spadek liczby pojedynczych klonów, które powstały w wyniku rekombinacji płciowej, o czym decyduje głównie dobór bardziej przystosowanych. Dlatego stosunek poszczególnych klonów w populacji na początku i na końcu epifitotyków może być zupełnie inny.
3. Opisany cykl jest charakterystyczny dla rodzimych populacji P. infestans w ich ojczyźnie, Ameryce Środkowej. W innych rejonach świata proces płciowy nie był znany od ponad 100 lat; grzybnia wegetatywna w porażonych bulwach ziemniaka była fazą zimowania. Cykl życiowy był całkowicie agamiczny, a rozprzestrzenianie się miało charakter ogniskowy: infekcja z pojedynczych zakażonych sadzonych bulw przenosiła się na liście, tworząc pierwotne ogniska choroby, które mogą łączyć się podczas masowego rozwoju choroby.
Tak więc w niektórych regionach może występować naprzemienność cykli seksualnych i bezpłciowych, podczas gdy w innych - tylko bezpłciowy cykl.
Pochodzenie P. INFESTANS
P. infestans pojawił się w Europie pod koniec pierwszej połowy XIX wieku. Ponieważ ziemniak pochodzi z północno-wschodniej Ameryki Południowej, przypuszczano, że pasożyt został sprowadzony stamtąd do Europy podczas boomu saletry chilijskiej. Jednak badania przeprowadzone w stacji ziemniaczanej Rockefeller Center w dolinie Toluca w Meksyku zmusiły do rewizji tego punktu widzenia (Niederhauser, 1991, 1993).
1. W dolinie Toluca lokalne bulwiaste gatunki ziemniaków (Solanum demissum, S. bulbocastanum, itp.) Mają różne zestawy genów odporności pionowej w połączeniu z wysokim poziomem niespecyficznej odporności, co wskazuje na długą koewolucję z pasożytem. Gatunki południowoamerykańskie, w tym ziemniaki uprawne, nie posiadają genów odporności.
2. W dolinie Toluca spotyka się izolaty z typami kojarzenia A1 i A2, w wyniku czego rozpowszechniona jest populacja międzyrasowa P. infestans; podczas gdy w ojczyźnie uprawianych ziemniaków, Ameryce Południowej, pasożyt rozprzestrzenia się klonalnie.
3. W dolinie Toluca corocznie występują poważne epidemie zarazy. Dlatego też wśród badaczy z Ameryki Północnej (Cornell University) ugruntowała się opinia o Mezoameryce (Ameryka Środkowa) jako kolebce ziemniaka phytophthora (Goodwin i in., 1994).
Badacze z Ameryki Południowej nie podzielają tej opinii. Uważają, że uprawiany ziemniak i jego pasożyt P. infestans mają wspólną ojczyznę - południowoamerykańskie Andy. Swój punkt widzenia poparli badaniami molekularnymi dotyczącymi analizy polimorfizmów DNA genomu mitochondrialnego (mtDNA) oraz genów jądrowych RAS i β-tubuliny (Gomez-Alpizar i in., 2007). Wykazali, że szczepy zebrane z różnych części świata pochodzą od trzech rozbieżnych linii przodków, które (wszystkie trzy) znajdują się w południowoamerykańskich Andach. Andyjskie haplotypy są potomkami dwóch linii: izolaty najstarszej linii mtDNA znajdują się na dziko rosnących Solanaceae z sekcji Anarrhicomenum w Ekwadorze, podczas gdy izolaty z drugiej linii są powszechne na ziemniakach, pomidorach i psiankowatych. W Toluca nawet rzadkie haplotypy pochodzą tylko z jednej linii, a zmienność genetyczna szczepów Toluca (niska częstość alleli niektórych zmiennych miejsc) sugeruje silny efekt założycielski z powodu niedawnego dryfu.
Ponadto w Andach znaleziono nowy gatunek P. andina, podobny morfologicznie i genetycznie do P. infestans, co zdaniem autorów wskazuje na Andy jako gorące miejsce specjacji w rodzaju Phytophthora. Wreszcie, w Europie i Stanach Zjednoczonych populacje P. Infestans obejmują obie linie andyjskie, podczas gdy w Toluca tylko jedną.
Ta publikacja wywołała odpowiedź grupy naukowców z różnych krajów, którzy wykonali wiele pracy eksperymentalnej, aby zrewidować poprzednie badanie (Goss i in., 2014). W tej pracy po pierwsze, wykorzystano bardziej pouczające sekwencje mikrosatelitarnego DNA do badania polimorfizmów DNA; po drugie, do analizy skupień, ścieżek migracji, czasu dywergencji populacji itp. zastosowano bardziej zaawansowane modele (statystyki F, przybliżenia bayesowskie itp.), a po trzecie porównano nie tylko z gatunkiem andyjskim P. andina, u którego ustalono charakter hybrydowy (P. infestans x Phytophthora sp.) , ale także z meksykańskimi gatunkami endemicznymi P. mirabilis, P. Ipomoeae i Phytophthora phaseoli - bliskimi genetycznie P. infestans należącymi do tego samego kladu (Kroon i in., 2012). W wyniku tych analiz jednoznacznie wykazano, że część korzeniowa drzewa filogenetycznego wszystkich badanych gatunków z rodzaju Phytophthora, z wyjątkiem hybrydy P. andina, należy do szczepów meksykańskich, a przepływ migracji ma kierunek Meksyk - Andy, a nie odwrotnie, a jego początek pokrywa się z europejskim. kolonizacja Nowego Świata (300-600 lat temu). Tak więc pojawienie się gatunku P. infestans, specjalizującego się w pokonywaniu ziemniaków, nastąpiło we wtórnym centrum genetycznym powstawania psiankowatych, tj. w Ameryce Środkowej.
Genom P. INFESTANS
W 2009 roku międzynarodowy zespół naukowców przeprowadził sekwencjonowanie całego genomu P infestans (Haas i in., 2009), którego rozmiar wynosił 240 MB. To kilkakrotnie więcej niż u blisko spokrewnionych gatunków P. sojae (95 Mb), powodujący zgniliznę korzeni soi i P. Ramorum (65 Mb), dotykający tak cennych gatunków drzew jak dąb, buk i inne. Uzyskane dane wykazały, że genom zawiera dużą liczbę kopii powtórzonych sekwencji - 74%. Genom zawiera 17797 genów kodujących białka, z których większość to geny zaangażowane w procesy komórkowe, w tym replikację DNA, transkrypcję i translację białek.
Porównanie genomów z rodzaju Phytophthora ujawniło niezwykłą organizację genomu, składającą się z bloków sekwencji genów konserwatywnych, w których gęstość genów jest stosunkowo wysoka, a zawartość sekwencji powtórzonych jest stosunkowo niewielka, a poszczególne regiony z sekwencjami genów niekonserwatywnych, o małej gęstości genów i dużej zawartości regionów powtarzających się. Konserwatywne bloki stanowią 70% (12440) wszystkich genów kodujących białka P. infestans. W obrębie bloków konserwatywnych geny są zwykle rozmieszczone blisko siebie, a średnia odległość międzygenowa wynosi 604 pz. W obszarach między konserwatywnymi blokami odległość międzygenowa jest większa (3700 pz) ze względu na wzrost gęstości powtarzających się elementów. Szybko rozwijające się efektorowe geny wydzielnicze są zlokalizowane w regionach ubogich w geny.
Analiza sekwencji genomu P. Infestans wykazała, że około jedna trzecia genomu należy do elementów zdolnych do transpozycji. Genom P. infestans zawiera znacznie więcej różnych rodzin transpozonów niż inne znane genomy. Większość transpozonów P. infestans należy do rodziny cygańskiej.
W genomie P. infestans zidentyfikowano dużą liczbę określonych rodzin genów zaangażowanych w patogenezę. Znaczna część z nich koduje białka efektorowe, które zmieniają fizjologię rośliny żywiciela i przyczyniają się do jej infekcji. Dzielą się one na dwie szerokie kategorie: efektory apoplastyczne, które działają w przestrzeniach międzykomórkowych (apoplastach) oraz efektory cytoplazmatyczne, które wchodzą do komórek przez haustorię. Do efektorów apoplastycznych należą wydzielane enzymy hydrolityczne, takie jak proteazy, lipazy i glikozylazy, które niszczą komórki roślinne; inhibitory enzymów obronnych rośliny żywicielskiej i toksyny nekrotyczne, takie jak białka podobne do Nep1 (NPL) i małe białka bogate w cysteinę (SCR) podobne do Pcf.
Geny efektorowe P. infestans są liczne i zwykle większe niż geny niepatogenne. Najbardziej znane to efektory cytoplazmatyczne RXLR i Crinkler (CNR). Typowymi efektorami cytoplazmatycznymi lęgniowców są białka RXLR. Wszystkie odkryte dotychczas geny efektorowe RXLR zawierają grupę końca aminowego Arg-XLeu-Arg, gdzie X jest aminokwasem. W wyniku badań zasugerowano, że w genomie P. infestans znajduje się 563 genów RXLR, czyli o 60% więcej niż u P. sojae i P. ramorum. Około połowa genów RXLR w genomie P. infestans jest specyficzna dla gatunku. Efektory RXLR mają szeroką gamę sekwencji. Wśród nich zidentyfikowano jedną dużą i 150 małych rodzin. W przeciwieństwie do głównego proteomu, geny efektorowe RXLR są zwykle zlokalizowane w regionach genomu ubogich w geny i bogatych w powtórzenia. Elementy ruchome, które determinują dynamizm tych regionów, ułatwiają rekombinację w tych genach.
Efekty cytoplazmatyczne CRN zostały pierwotnie zidentyfikowane w transkryptach P. infestans kodujących peptydy wywołujące martwicę tkanek roślinnych. Od czasu ich odkrycia niewiele wiadomo o rodzinie tych efektorów. Analiza genomu P. Infestans ujawniła ogromną rodzinę 196 genów CRN, która jest znacznie większa niż u P. sojae (100 CRN) i P. ramorum (19 CRN). Podobnie jak RXLR, CRN są białkami modułowymi i składają się z wysoce konserwatywnej N-końcowej domeny LFLAK (50 aminokwasów) i sąsiedniej domeny DWL zawierającej różne geny. Większość CRN (60%) posiada peptyd sygnałowy.
Zbadano możliwość zakłócania procesów komórkowych rośliny żywiciela przez różne CRN. W analizie nekrozy roślin usunięcie białek CRN2 umożliwiło zidentyfikowanie regionu C-końcowego składającego się z 234 aminokwasów (pozycje 173-407, domena DXG) i powodującego śmierć komórki. Analiza genów P. infestans CRN ujawniła cztery różne regiony C-końcowe, które również powodują śmierć komórki w roślinie. Należą do nich nowo zidentyfikowane domeny DC (P. Infestans ma 18 genów i 49 pseudogenów), a także domeny D2 (14 i 43) i DBF (2 i 1), które są podobne do kinaz białkowych. Białka domen CRN ulegających ekspresji w roślinie są konserwowane (przy braku peptydów sygnałowych) w komórce roślinnej i stymulują śmierć komórki poprzez mechanizm wewnątrzkomórkowy. Kolejnych 255 sekwencji zawierających domeny CRN najprawdopodobniej nie działa jako geny.
Wzrost liczby i wielkości rodzin genów efektorowych RXLR i CRN był przypuszczalnie spowodowany niealleliczną rekombinacją homologiczną i duplikacją genów. Pomimo faktu, że genom zawiera dużą liczbę aktywnych elementów mobilnych, nadal nie ma bezpośrednich dowodów na transfer genów efektorowych.
Metody stosowane w badaniu struktury populacji
Badanie struktury genetycznej populacji opiera się obecnie na analizie czystych kultur jej szczepów składowych. Analizę populacji bez izolowania czystych upraw przeprowadza się również w określonych celach, takich jak np. Badanie agresywności populacji czy obecności w niej szczepów odpornych na fungicydy (Filippov i in., 2004; Derevyagina i in., 1999). W tego typu badaniach stosuje się specjalne metody, których opis wykracza poza zakres niniejszego przeglądu. Do analizy porównawczej szczepów stosuje się szereg metod opartych zarówno na analizie struktury DNA, jak i badaniu objawów fenotypowych. Analiza porównawcza populacji ma do czynienia z dużą liczbą izolatów, co nakłada pewne wymagania na stosowane metody. W idealnym przypadku powinny spełniać następujące wymagania (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- być tani, łatwy w realizacji, nie wymagający znacznych nakładów czasowych, oparty na ogólnie dostępnych technologiach (np. PCR);
- musi generować dostatecznie dużą liczbę niezależnych cech znaczników kodominujących;
- mają wysoką odtwarzalność;
- użyć minimalnej ilości tkanki do zbadania;
- być specyficzne dla podłoża (zanieczyszczenie obecne w kulturze nie powinno wpływać na wyniki);
- nie wymagają stosowania niebezpiecznych procedur i silnie toksycznych chemikaliów.
Niestety nie ma metod odpowiadających wszystkim powyższym parametrom. Do badań porównawczych szczepów w naszych czasach wykorzystuje się metody oparte na analizie cech fenotypowych: wirulencji odmian ziemniaka i pomidora (rasy ziemniaka i pomidora), rodzaju krycia, widm izoenzymów peptydazy i izomerazy glukozo-6-fosforanowej oraz analizie struktury DNA: polimorfizm długości fragment restrykcyjny (RFLP), który jest zwykle uzupełniany sondą hybrydyzacyjną RG 57, analiza powtórzeń mikrosatelitarnych (SSR i InterSSR), amplifikacja z losowymi starterami (RAPD), amplifikacja fragmentów restrykcyjnych (AFLP), amplifikacja starterami homologicznymi do sekwencji elementów ruchomych (np. SINE PCR), oznaczanie haplotypów mitochondrialnego DNA.
Krótki opis metod badania porównawczego szczepów użytych w pracy z P. Infestans
Cechy markera fenotypowego
Wyścigi „ziemniaków”
Rasy „ziemniaków” są powszechnie badanym i używanym markerem. Rasy „proste ziemniaki” mają jeden gen zjadliwości ziemniaka, a „złożone” - co najmniej dwa. Black i wsp. (1953), podsumowując wszystkie dostępne im dane, stwierdzili, że rasa phytophthora jest zdolna do zakażania roślin genem / genami odporności odpowiadającymi genom / genom wirulencji P. infestans i odkryli rasy 1, 2, 3 i 4, które infekują rośliny odpowiednio z genami R1, R2, R3 i R4, tj. interakcja między pasożytem a żywicielem zachodzi zgodnie z zasadą genu dla genu. Ponadto Black, z udziałem Gallegly i Malcolmson, odkrył geny odporności R5, R6, R7, R8, R9, R10 i R11, a także odpowiadające im rasy (Black, 1954; Black i Gallegly, 1957; Malcolmson i Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Istnieje obszerny zbiór danych na temat składu rasowego patogenu z różnych regionów. Bez szczegółowej analizy tych danych wskażemy tylko ogólny trend: tam, gdzie stosowano odmiany z nowymi genami odporności lub ich kombinacje, początkowo nastąpiło osłabienie zarazy, ale potem pojawiły się rasy z odpowiednimi genami zjadliwości i zostały wyselekcjonowane i wznowiono wybuch zarazy. Specyficzną zjadliwość wobec pierwszych 4 genów odporności (R1-R4) rzadko obserwowano w kolekcjach zebranych przed wprowadzeniem do hodowli odmian z tymi genami, ale liczba zjadliwych szczepów gwałtownie wzrosła, gdy patogen został spasożytowany na odmianach niosących te geny. Z drugiej strony geny 5-11 były dość powszechne w kolekcjach (Shaw, 1991).
Badanie proporcji różnych ras w okresie wegetacyjnym przeprowadzone pod koniec lat 1980.XX wieku wykazało, że na początku rozwoju choroby w populacji przeważają klony o niskiej agresywności i 1-2 genach wirulencji.
Ponadto, wraz z rozwojem zarazy późnej, stężenie pierwotnych klonów maleje, a liczba ras „złożonych” o wysokiej agresywności wzrasta. Występowanie tego ostatniego pod koniec sezonu sięga 100%. Podczas przechowywania bulw następuje spadek agresywności i utrata poszczególnych genów zjadliwości. Dynamika zastępowania klonów może zachodzić w różnych odmianach na różne sposoby (Rybakova i Dyakov, 1990). Jednak nasze badania w latach 2000-2010 wykazały, że złożone rasy występują od samego początku epifitotyków wśród szczepów izolowanych zarówno z ziemniaków, jak i pomidorów. Jest to prawdopodobnie spowodowane zmianą populacji P. Infestans w Rosji.
W latach 1988-1995 częstość występowania „superras” ze wszystkimi lub prawie wszystkimi genami wirulencji w różnych regionach osiągnęła 70-100%. Taką sytuację odnotowano m.in. na Białorusi, w obwodzie leningradzkim, moskiewskim, w Osetii Północnej oraz w Niemczech (Ivanyuk i in., 2002a, 2002b; Politiko, 1994; Schober-Butin i in., 1995).
Wyścigi „pomidorów”
W odmianach pomidora stwierdzono tylko 2 geny odporności na zarazę zarazą - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) i Ph2 (Al-Kherb, 1988). Podobnie jak w przypadku ras ziemniaków, interakcja między pomidorami a P. infestans zachodzi na zasadzie gen po genie. Rasa T0 infekuje odmiany, które nie mają genów odporności (większość odmian stosowanych w przemyśle), rasa T1 infekuje odmiany genem Ph1 (Ottawa), a rasa T2 infekuje odmiany genem Ph2.
W Rosji prawie wyłącznie T0 znaleziono na ziemniakach; T0 dominowała na pomidorach na początku sezonu, ale później została zastąpiona rasą T1 (Dyakov i in., 1975, 1994). Po 2000 roku T1 na ziemniakach w wielu populacjach zaczęła pojawiać się na samym początku epifitozy. W Stanach Zjednoczonych odmiany ziemniaka były niepatogenne dla pomidorów, a także rasy T0, T1 i T2, podczas gdy na pomidorach dominowały odmiany T1 i T2 (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin i in., 1995).
Typ krycia
Do badania wymagane są szczepy testowe (referencyjne) o znanych typach kojarzenia - A1 i A2. Testowany izolat zaszczepia się nimi parami na szalkach Petriego z agarem owsianym. Po inkubacji przez 10 dni płytki bada się pod kątem obecności lub braku oospor w pożywce w strefie kontaktu szczepów. Istnieją 4 możliwości: szczep należy do typu krycia A1, jeśli tworzy oospory z testerem A2, do A2, jeśli tworzy oospory z testerem A1, do A1A2, jeśli tworzy oospory z obydwoma testerami, lub jest sterylny (00), jeśli nie tworzy oosporów bez testera (ostatnie dwie grupy są rzadkie).
Aby szybciej określić typy kojarzeń, podjęto próby zidentyfikowania regionów genomu powiązanych z rodzajem kojarzenia, aby dalej wykorzystać je do określenia typu kojarzenia metodą PCR. Jeden z pierwszych udanych eksperymentów mających na celu zidentyfikowanie takiego miejsca został przeprowadzony przez amerykańskich badaczy (Judelson i in., 1995). Korzystając z metody RAPD, byli w stanie zidentyfikować region W16 związany z typem kojarzenia u potomstwa dwóch skrzyżowanych izolatów i zaprojektować parę starterów o długości 24 pz do jej amplifikacji (W16-1 (5'-AACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') i W16-2 (5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Po restrykcji produktu PCR enzymem restrykcyjnym HaeIII, możliwe było rozdzielenie izolatów parami typu A1 i A2.
Kolejną próbę uzyskania markerów PCR w celu określenia typów kojarzeń podjęli badacze koreańscy (Kim, Lee, 2002). Zidentyfikowali konkretne produkty za pomocą metody AFLP. W rezultacie opracowano parę starterów PHYB-1 (do przodu) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') i PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'), umożliwiając selektywną amplifikację regionu genomu związanego z typem krycia A2. Następnie kontynuowali tę pracę i zaprojektowali startery 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, forward) i 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), umożliwiające selektywną amplifikację regionu Mat-A1 charakterystycznego dla szczepów o typie krycia A1. Zastosowanie diagnostyki PCR typów kojarzeń dało dobre wyniki w badaniach populacji P. infestans w Czechach (Mazakova i in., 2006), Tunezji (Jmour, Hamada, 2006) i innych regionach. W naszym laboratorium (Mytsa, Elansky, niepublikowane) przeanalizowano 34 szczepy P. infestans wyizolowane z chorych organów ziemniaka i pomidora w różnych regionach Rosji (Kostroma, Riazań, Astrachań, obwody moskiewskie). Wyniki analizy PCR z użyciem specyficznych starterów w ponad 90% zbiegły się z wynikami analizy typu krycia metodą tradycyjną na pożywce.
Tabela 1. Zmienność odporności w obrębie klonu Sib 1 (Elansky et al., 2001)
Miejsce pobrania próbki | Liczba przeanalizowanych izolatów | Liczba szczepów wrażliwych (S), słabo odpornych (SR) i odpornych (R), szt. (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Władywostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkuck | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnojarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Miasto Jekaterynburg | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sachalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Region Omsk | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Oporność na metalaksyl jako marker populacji
We wczesnych latach osiemdziesiątych XX wieku w różnych regionach odnotowano potężne wybuchy zarazy wywołanej przez oporne na metalaksyl szczepy P. infestans. Farmy ziemniaków w wielu krajach poniosły znaczne straty (Dowley i O'Sullivan, 1980; Davidse i in., 1981; Derevyagina, 1983). Od tego czasu w wielu krajach świata prowadzony jest stały monitoring występowania szczepów opornych na fenyloamid w populacjach P. infestans. Oprócz praktycznej oceny perspektyw stosowania leków zawierających fenyloamid, budowania systemu działań ochronnych i przewidywania epifitotii, oporność na te leki stała się jednym z powszechnie stosowanych markerów do analizy porównawczej populacji tego patogenu. Jednak zastosowanie oporności na metalaksyl w porównawczych badaniach populacyjnych powinno być prowadzone z uwzględnieniem faktu, że: 1991 - genetyczne podstawy oporności nie zostały jeszcze precyzyjnie określone, 1 - oporność na metalaksyl jest cechą selektywnie zależną, która może zmieniać się w zależności od stosowania fenyloamidów, 2 - różna stopień wrażliwości na szczepy metalaksylu w obrębie jednej linii klonalnej (tabela 3).
Widma izozymów
Markery izozymów są zwykle niezależne od warunków zewnętrznych, wykazują dziedziczenie mendlowskie i są kodominujące, co pozwala na rozróżnienie homo- i heterozygot. Zastosowanie białek jako markerów genów umożliwia identyfikację zarówno dużych reorganizacji materiału genetycznego, w tym mutacji chromosomowych i genomowych, jak i substytucji pojedynczych aminokwasów.
Badania elektroforetyczne białek wykazały, że większość enzymów występuje w organizmach w postaci kilku frakcji różniących się ruchliwością elektroforetyczną. Te frakcje są wynikiem kodowania wielu form enzymów przez różne loci (izoenzymy lub izozymy) lub przez różne allele tego samego locus (allozymy lub alloenzymy). Oznacza to, że izoenzymy są różnymi formami jednego enzymu. Różne formy mają taką samą aktywność katalityczną, ale różnią się nieznacznie podstawieniami pojedynczych aminokwasów w peptydzie i odpowiedzialnością. Takie różnice ujawniają się podczas elektroforezy.
Podczas badania szczepów P. infestans wykorzystuje się widma izoenzymów dwóch białek, peptydazy i izomerazy glukozo-6-fosforanowej (enzym ten jest monomorficzny w populacjach rosyjskich, dlatego w pracy nie przedstawiono metod jego badania). Aby rozdzielić je na izozymy w polu elektrycznym, preparaty białkowe wyizolowane z badanych organizmów nanosi się na płytkę żelową umieszczoną w polu elektrycznym. Szybkość dyfuzji poszczególnych białek w żelu zależy od ładunku i masy cząsteczkowej, dlatego w polu elektrycznym mieszanina białek jest rozdzielana na poszczególne frakcje, które można wizualizować za pomocą specjalnych barwników.
Badanie izoenzymów peptydazy prowadzi się na żelach z octanu celulozy, skrobi lub poliakryloamidu. Najdogodniejsza jest metoda oparta na zastosowaniu żeli octanu celulozy firmy Helena Laboratories Inc. Nie wymaga dużej ilości badanych materiałów, pozwala na uzyskanie kontrastowych pasm na żelu po elektroforezie dla obu loci enzymów, jego realizacja nie wymaga dużego nakładu czasu i materiału (ryc. 2).
Mały kawałek grzybni przenosi się do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml i dodaje do niej 1-2 krople wody destylowanej. Następnie próbkę homogenizuje się (na przykład za pomocą wiertarki elektrycznej z plastikową nasadką odpowiednią dla mikroprobówki) i osadza przez 25 sekund na wirówce przy 13000 obr / min. 8 μl z każdej mikroprobówki. supernatant przenosi się na płytkę aplikatora.
Żel z octanu celulozy wyjmuje się z pojemnika buforowego, osusza między dwoma arkuszami bibuły filtracyjnej i umieszcza warstwą roboczą na wierzchu plastikowej podstawy aplikatora. Roztwór z płytki nanosi się aplikatorem na żel 2-4 razy. Żel przenosi się do komory do elektroforezy,
Tabela 2. Skład roztworu używanego do barwienia żelu octanu celulozy w analizie izoenzymów peptydazy, kroplę farby (błękit bromofenolowy) umieszcza się na krawędzi żelu.
TRIS HCl, 0,05 M, Ph 8,0 2 ml
Peroksydaza, 1000 U / ml 5 kropli
o-dianizydyna, 4 mg / ml 8 kropli
MgCl2, 20 mg / ml 2 krople
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 kropli
Oksydaza L-aminokwasu, 20 u / ml 2 krople
Elektroforezę przeprowadza się przez 20 minut. przy 200 V. Po elektroforezie żel przenosi się na stół malarski i barwi specjalnym roztworem malarskim (tab. 2). 10 ml 1,6% agaru DIFCO topi się wstępnie w kuchence mikrofalowej, schładza do 60 ° C, po czym miesza się 2 ml agaru z mieszaniną farb i wylewa na żel. Paski pojawiają się w ciągu 15-20 minut. Odczynnik oksydazy L-aminokwasu dodaje się bezpośrednio przed zmieszaniem roztworu ze stopionym agarem.
W populacjach rosyjskich locus Pep 1 jest reprezentowany przez genotypy 100/100 i 92/100. Homozygota 92/92 występuje niezwykle rzadko (około 0,1%). Locus Rehr 2 jest reprezentowany przez trzy genotypy 100/100, 100/112 i 112/112, a wszystkie 3 warianty są dość powszechne (Elanky i Smirnov, 2003, ryc. 2).
Badania genomu
Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych z późniejszą hybrydyzacją (RFLP-RG 57)
Całość DNA traktuje się enzymem restrykcyjnym Eco R1, fragmenty DNA rozdziela przez elektroforezę w żelu agarozowym. DNA jądrowe jest bardzo duże i ma wiele powtarzalnych sekwencji, co utrudnia bezpośrednią analizę licznych fragmentów otrzymanych w wyniku działania enzymów restrykcyjnych. Dlatego fragmenty DNA oddzielone w żelu przenosi się na specjalną membranę i wykorzystuje do hybrydyzacji z sondą RG 57, która zawiera nukleotydy znakowane radioaktywnymi lub fluorescencyjnymi znacznikami. Sonda ta hybrydyzuje z powtarzającymi się sekwencjami genomowymi (Goodwin i wsp., 1992, Forbes i wsp., 1998). Po wizualizacji wyników hybrydyzacji na lekkim lub radioaktywnym materiale uzyskuje się profil hybrydyzacji z wieloma lokusami (odcisk palca), reprezentowany przez 25-29 fragmentów (Forbes i wsp., 1998). Potomstwo bezpłciowe (klonalne) będzie miało te same profile. Dzięki rozmieszczeniu prążków na elektroforetogramie można ocenić podobieństwa i różnice porównywanych organizmów.
Haplotypy mitochondrialnego DNA
W większości komórek eukariotycznych mtDNA występuje w postaci dwuniciowej kolistej cząsteczki DNA, która w przeciwieństwie do chromosomów jądrowych komórek eukariotycznych replikuje półkonserwatywnie i nie jest związana z cząsteczkami białka.
Zsekwencjonowano mitochondrialny genom P. infestans i poświęcono szereg prac analizie długości fragmentów restrykcyjnych (Carter i wsp., 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Po opracowaniu przez Griffitha i Shawa (1998) prostej i szybkiej metody oznaczania haplotypów mtDNA, marker ten stał się jednym z najpopularniejszych w badaniach P. Infestans. Istota metody polega na sekwencyjnej amplifikacji dwóch fragmentów mitochondrialnego DNA (ze wspólnego genomu) za pomocą starterów F2-R2 i F4-R4 (tabela 3) i ich późniejsza restrykcja enzymami restrykcyjnymi MspI (pierwszy fragment) i EcoR1 (drugi fragment). Metoda pozwala zidentyfikować 1 haplotypy: Ia, IIa, Ib, IIb. Typ II różni się od typu I obecnością wstawki o wielkości 2 bp i inną lokalizacją miejsc restrykcyjnych w regionach P4 i P1881 (ryc. 2).
Od 1996 roku wśród szczepów zebranych na terytorium Rosji odnotowano jedynie haplotypy Ia i IIa (Elansky i in., 2001, 2015). Można je zidentyfikować po oddzieleniu produktów restrykcji za pomocą startera F2-R2 w polu elektrycznym (rys. 4, 5). Rodzaje mtDNA są używane w analizie porównawczej szczepów i populacji. W wielu pracach do izolacji linii klonalnych i paszportyzacji izolatów P. infestans wykorzystano typy mitochondrialnego DNA (Botez i in., 2007; Shein i in., 2009). Korzystając z metody PCR-RFLP, stwierdzono, że mtDNA jest heterogenny w tym samym szczepie P. infestans (Elansky i Milyutina, 2007). Warunki amplifikacji: 1x (500 s. 94 ° C), 40x (30 s. 90 ° C, 30 s. 52 ° C, 90 s. 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Mieszanina reakcyjna: (20 μl): 0,2 U polimerazy Taq DNA, 1x 2,5 mM bufor MgCl2-Taq, 0,2 mM każdy dNTP, 30 pM starter i 5 ng analizowanego DNA, woda dejonizowana - do 20 μl.
Ograniczenie produktu PCR prowadzi się przez 4-6 godzin w temperaturze 37 ° C. Mieszanina restrykcyjna (20 μl): 10x MspI (2 μl), 10x bufor restrykcyjny (2 μl), woda dejonizowana (6 μl), produkt PCR (10 μl).
Tabela 3. Startery użyte do amplifikacji regionów polimorficznych mtDNA
Umiejscowienie | Primer | Długość i położenie podkładu | Długość produktu PCR | Restrictase |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619–13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688–14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGGTTTATGTT | 22; 9329–9350 | 964 | EcoRI |
R4: 5 – CCGATAACCGATAACCAGCACCAA | 22; 10292–10271 |
Amplifikacja losowego startera (RAPD)
Podczas wykonywania RAPD stosuje się jeden starter (czasem kilka starterów jednocześnie) z dowolną sekwencją nukleotydową, zwykle o długości 10 nukleotydów, o dużej zawartości (od 50%) nukleotydów GC i niskiej temperaturze renaturacji (około 35 ° C). Takie startery „lądują” w wielu komplementarnych miejscach w genomie. Po amplifikacji otrzymuje się dużą liczbę amplikonów. Ich liczba zależy od zastosowanego podkładu (-ów) i warunków reakcji (stężenie MgCl2 i temperatura wyżarzania).
Wizualizację amplikonów przeprowadza się przez destylację w żelu poliakrylamidowym lub agarozowym. Wykonując analizę RAPD, należy uważnie monitorować czystość analizowanego materiału, ponieważ zanieczyszczenie innymi żywymi obiektami może spowodować znaczny wzrost liczby artefaktów, których w analizie czystego materiału jest dość dużo (Perez i in., 1998). Zastosowanie tej metody w badaniach genomu P. infestans znajduje odzwierciedlenie w wielu pracach (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire i in., 2002, Carlisle i in., 2001). Wybór warunków reakcji i starterów (przebadano 51 starterów 10-nukleotydowych) podany jest w artykule Abu-El Samen i in., (2003).
Analiza powtórzeń mikrosatelitarnych (SSR)
Powtórzenia mikrosatelitarne (proste powtórzenia sekwencji, SSR) to tandemowo powtarzające się krótkie sekwencje 1-3 (czasem do 6) nukleotydów obecne w genomach jądrowych wszystkich eukariotów. Liczba kolejnych powtórzeń może wahać się od 10 do 100. Loci mikrosatelitarne występują z dość dużą częstotliwością i są mniej więcej równomiernie rozmieszczone w całym genomie (Lagercrantz et al., 1993). Polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych wiąże się z różnicami w liczbie powtórzeń motywu podstawowego. Markery mikrosatelitarne są kodominujące, co umożliwia wykorzystanie ich do analizy struktury populacji, określenia pokrewieństwa, ścieżek migracji genotypów itp. Wśród innych zalet tych markerów należy zwrócić uwagę na ich wysoki polimorfizm, dobrą odtwarzalność, neutralność oraz możliwość automatycznej analizy i oceny. Analiza polimorfizmu powtórzeń mikrosatelitarnych jest przeprowadzana metodą amplifikacji PCR z użyciem starterów komplementarnych do unikalnych sekwencji flankujących loci mikrosatelitarne. Początkowo analizę prowadzono z rozdziałem produktów reakcji na żelu poliakryloamidowym. Później pracownicy firmy Applied Biosystems zaproponowali zastosowanie do detekcji produktów reakcji za pomocą automatycznego detektora laserowego starterów znakowanych fluorescencyjnie (Diehl i wsp., 1990), a następnie standardowych automatycznych sekwencerów DNA (Ziegle i wsp., 1992). Znakowanie starterów różnymi barwnikami fluorescencyjnymi pozwala na analizę kilku markerów jednocześnie na jednej ścieżce i odpowiednio znacznie zwiększa produktywność metody i zwiększa dokładność analizy.
Pierwsze publikacje poświęcone wykorzystaniu analizy SSR do badań P. infestans pojawiły się na początku XXI wieku. (Knapova, Gisi, 2000). Nie wszystkie zaproponowane przez autorów markery wykazywały wystarczający stopień polimorfizmu, jednak dwa z nich (2002B i G4) znalazły się w zestawie 11 markerów SSR zaproponowanych przez Lees i in. (12), a następnie zaadoptowano w sieci badawczej Eucablight (www.eucablight .org) jako standard dla P. infestans. Kilka lat później opublikowano badanie dotyczące stworzenia systemu do analizy multipleksowej DNA P. infestans opartego na ośmiu markerach SSR (Li i in., 2006). Wreszcie, po dokonaniu oceny wszystkich wcześniej zaproponowanych markerów i wybraniu najbardziej informatywnych z nich, a także optymalizacji starterów, znaczników fluorescencyjnych i warunków amplifikacji, ta sama grupa autorów przedstawiła system jednoetapowej analizy multipleksowej obejmujący 2010 markerów (Tabela 12; Li i in. , 4a). Startery stosowane w tym systemie wybrano i wyznakowano jednym z czterech markerów fluorescencyjnych (FAM, VIC, NED, PET) tak, aby zakresy wielkości alleli starterów z tymi samymi znacznikami nie zachodziły na siebie.
Autorzy przeprowadzili analizę na wzmacniaczu PTC200 (MJ Research, USA) przy użyciu zestawów multipleksowej PCR firmy QIAGEN lub zestawów do PCR firmy QIAGEN Typeit Microsat Satellite PCR. Objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 12.5 µl. Warunki amplifikacji były następujące: dla QIAGEN multipleks PCR: 95 ° C (15 min), 30x (95 ° C (20 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (60 s), 72 ° C (20 min)); dla QIAGEN Type-it Microsat Satellite PCR: 95 ° C (5 min), 28x (95 ° C (30 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (20 s), 60 ° C (30 min).
Rozdzielanie i wizualizację produktów PCR przeprowadzono przy użyciu automatycznego analizatora kapilarnego DNA ABI3730 (Applied Biosystems).
Tabela 4. Charakterystyka 12 standardowych markerów SSR używanych do genotypowania P. Infestans (Li i in., 2013a)
Nazwa | Liczba alleli | Zakres rozmiarów allele (bp) | Podkłady |
Świnka11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
ft02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTCAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | F: FAM-TCTTGTTCGAGTATGCGAGCG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
ft04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
ft70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTCTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
ft63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Przykład wizualizacji wyników analizy przedstawiono na rys. 6. Wyniki analizowano za pomocą oprogramowania GeneMapper 3.7, porównując otrzymane dane z danymi znanych izolatów. Aby ułatwić interpretację wyników analizy, konieczne jest włączenie do każdego badania 1-2 izolatów referencyjnych o znanym genotypie.
Zaproponowana metoda badawcza została przetestowana na znacznej liczbie próbek terenowych, po czym autorzy przeprowadzili standaryzację protokołów pomiędzy laboratoriami dwóch organizacji, The James Hutton Institute (Wielka Brytania) oraz Wageningen University & Research (Holandia), co wraz z możliwością wykorzystania standardowych kart FTA do uproszczonych pobranie i wysyłka próbek DNA P. infestans, pozwoliło porozmawiać o możliwości komercyjnego wykorzystania tego opracowania. Ponadto szybka i dokładna metoda genotypowania izolatów P. infestans z wykorzystaniem multipleksowej analizy SSR umożliwiła przeprowadzenie standaryzowanych badań populacji tego patogenu w skali globalnej oraz stworzenie światowej bazy danych na temat zarazy w ramach projektu Eucablight (www.eucablight.org), w tym m.in. , w tym wyniki analizy mikrosatelitarnej, umożliwiły śledzenie powstawania i rozprzestrzeniania się nowych genotypów na całym świecie.
Powielony polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (AFLP). AFLP (polimorfizm długości amplifikowanego fragmentu) to technologia generowania losowych markerów molekularnych przy użyciu specyficznych starterów. W AFLP DNA jest traktowane kombinacją dwóch enzymów restrykcyjnych. Do lepkich końców fragmentów restrykcyjnych liguje się określone adaptery.
Te fragmenty są następnie amplifikowane przy użyciu starterów komplementarnych do sekwencji adaptora i miejsca restrykcyjnego i dodatkowo niosących jedną lub więcej losowych zasad na swoich końcach 3 '. Zestaw otrzymanych fragmentów zależy od enzymów restrykcyjnych i losowo wybranych nukleotydów na 3'-końcach starterów (Vos i wsp., 1995). AFLP - genotypowanie służy do szybkiego badania zmienności genetycznej różnych organizmów.
Szczegółowy opis metody znajduje się w pracach Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul i in., 1999. Wiele prac porównujących rozdzielczość metod AFLP i SSR wykonali chińscy badacze. Zbadano cechy fenotypowe i genotypowe 48 izolatów P. infestans zebranych z pięciu regionów północnych Chin. Widma AFLP ujawniły osiem różnych genotypów DNA, w przeciwieństwie do genotypów SSR, dla których nie stwierdzono różnorodności (Guo i in., 2008).
Amplifikacja za pomocą starterów homologicznych do sekwencji elementów ruchomych
Markery pochodzące z sekwencji retrotranspozonów są bardzo wygodne w mapowaniu genetycznym, badaniu różnorodności genetycznej i procesów ewolucyjnych (Schulman, 2006). Jeśli stworzone zostaną startery, które będą uzupełniać stabilne sekwencje pewnych elementów mobilnych, możliwa jest amplifikacja regionów genomu znajdujących się między nimi. W badaniach czynnika wywołującego zarazę zarazy z powodzeniem zastosowano metodę amplifikacji części genomu przy użyciu startera komplementarnego do sekwencji rdzeniowej retropazonu SINE (Short Interspersed Nuclear Elements) (Lavrova i Elansky, 2003). Za pomocą tej metody różnice ujawniono nawet u bezpłciowego potomstwa jednego izolatu. W związku z tym stwierdzono, że metoda inter - SINE - PCR jest wysoce specyficzna, a szybkość ruchu elementów SINE w genomie Phytophthora jest wysoka.
W genomie P. infestans zidentyfikowano 12 rodzin krótkich retrotranspozonów (SINE); zbadano rozmieszczenie gatunkowe krótkich retrotranspozonów; ujawniono elementy (SINE), które znajdują się w genomie tylko P. infestans (Lavrova, 2004).
Cechy zastosowania metod badań porównawczych szczepów w badaniach populacyjnych
Planując badanie, konieczne jest jasne zrozumienie celów, do których dąży, i zastosowanie odpowiednich metod. Stąd niektóre metody pozwalają na generowanie dużej liczby niezależnych cech markerowych, ale jednocześnie charakteryzują się niską powtarzalnością i silnie zależą od zastosowanych odczynników, warunków reakcji i zanieczyszczenia badanego materiału. Dlatego w każdym badaniu grupy szczepów konieczne jest użycie kilku izolatów wzorcowych (referencyjnych), ale nawet w tym przypadku wyniki kilku eksperymentów są bardzo trudne do połączenia.
Ta grupa metod obejmuje RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Po amplifikacji otrzymuje się dużą liczbę fragmentów DNA o różnych rozmiarach. Zaleca się stosowanie takich technik, jeśli konieczne jest ustalenie różnic między blisko spokrewnionymi szczepami (potomstwo rodzicielskie, mutanty typu dzikiego itp.) Lub w przypadkach, gdy wymagana jest szczegółowa analiza małej próbki. Tak więc metoda AFLP jest szeroko stosowana w mapowaniu genetycznym P. infestans (van der Lee i wsp., 1997) oraz w badaniach intrapopulacji (Knapova, Gisi, 2002, Cooke i wsp., 2003, Flier i wsp., 2003). Takie metody są nieodpowiednie przy tworzeniu baz danych szczepów, ponieważ praktycznie niemożliwe jest ujednolicenie księgowania wyników podczas przeprowadzania analiz w różnych laboratoriach.
Pomimo pozornej prostoty i szybkości wykonania (izolacja DNA bez dobrego oczyszczenia, amplifikacji, wizualizacji wyników) ta grupa metod wymaga zastosowania specjalnej metody dokumentowania wyników: destylacji w żelu poliakryloamidowym ze znakowanymi (radioaktywnymi lub luminescencyjnymi) starterami i późniejszej ekspozycji na światło lub materiał radioaktywny. Konwencjonalne obrazowanie w żelu agarozowym z bromkiem etydyny generalnie nie jest odpowiednie dla tych metod, ponieważ duża liczba fragmentów DNA o różnych rozmiarach może się łączyć.
Natomiast inne metody pozwalają na generowanie niewielkiej liczby cech o bardzo wysokiej powtarzalności. Do tej grupy zalicza się badanie haplotypów mitochondrialnego DNA (w Rosji odnotowano tylko dwa haplotypy Ia i IIa), typ kojarzenia (większość izolatów dzieli się na 2 typy: A1 i A2, rzadko występuje samozapłodnienie SF) oraz widma izozymów peptydazy (dwa loci Pep1 i Pep2 składający się z dwóch izozymów każdy) oraz izomerazy glukozo-6-fosforanowej (w Rosji nie ma zmienności tej cechy, chociaż w innych krajach świata obserwuje się znaczny polimorfizm). Zaleca się korzystanie z tych funkcji podczas analizy zbiorów, tworzenia regionalnych i globalnych baz danych. W przypadku analizy izozymów i haplotypów mitochondrialnego DNA można w ogóle obejść się bez szczepów standardowych, natomiast przy analizie typów kojarzeń wymagane są dwa izolaty testowe o znanych typach kojarzeń.
Warunki reakcji i odczynniki mogą wpływać tylko na kontrast produktu na elektroforetogramie; pojawienie się artefaktów w tego typu badaniach jest mało prawdopodobne.
Obecnie większość populacji w europejskiej części Rosji reprezentowana jest przez szczepy obu typów kojarzeń (tab.6), wśród nich izolaty o typach Ia i IIa mitochondrialnego DNA (inne typy mtDNA występujące na świecie nie zostały znalezione w Rosji po 1993 roku). Widma izozymów peptydazy są reprezentowane przez dwa genotypy w locus Pep1 (100/100, 92/92 i heterozygota 92/100, a genotyp 92/92 jest niezwykle rzadki (<0,3%)) i przez dwa genotypy w locus Pep 2 (100/100 , 112/112 i heterozygota 100/112, przy czym genotyp 112/112 występuje rzadziej niż 100/100, ale też dość często).
Nie stwierdzono zmienności w widmie izozymów izomerazy glukozo-6-fosforanowej po 1993 r. (Zanik linii klonalnej US-1); wszystkie badane izolaty miały genotyp 100/100 (Elansky i Smirnov, 2002).
Trzecia grupa metod pozwala na uzyskanie wystarczającej grupy niezależnych markerów o wysokiej powtarzalności. Dziś do tej grupy należy sonda RFLP-RG57, która wytwarza 25-29 fragmentów DNA o różnej wielkości. RFLP-RG57 może być używany zarówno podczas analizy próbek, jak i tworzenia baz danych. Jednak ta metoda jest znacznie droższa od poprzednich, jest czasochłonna i wymaga odpowiednio dużej ilości wysoko oczyszczonego DNA. Dlatego badacz jest zmuszony do ograniczenia objętości badanego materiału.
Rozwój RFLP-RG57 na początku lat 90. ubiegłego wieku znacznie zintensyfikował badania populacyjne czynnika wywołującego zarazę zarazy. Stało się podstawą metody opartej na selekcji i analizie „linii klonalnych” (patrz poniżej). Wraz z RFLP-RG57, typ kojarzenia, odcisk palca DNA (metoda RFLP-RG57), widma izoenzymów peptydazy i izomerazy glukozo-6-fosforanu oraz typ mitochondrialnego DNA są wykorzystywane do identyfikacji linii klonalnych. Dzięki niemu pokazano al., 1994), zastąpienie starych populacji nowymi (Drenth i in., 1993, Sujkowski i in., 1994, Goodwin i in., 1995a), ujawniło linie klonalne dominujące w wielu krajach świata. Badania rosyjskich szczepów tą metodą wykazały wysoki polimorfizm genotypowy szczepów części europejskiej oraz monomorfizm populacji azjatyckiej i dalekowschodniej części Rosji (Elansky i in., 2001). A teraz ta metoda pozostaje główną metodą w badaniach populacyjnych P. infestans. Jednak jego szerokie rozpowszechnienie jest utrudnione przez dość wysoki koszt i pracochłonność wykonania.
Inną obiecującą techniką, która jest rzadko stosowana w badaniach P. infestans, jest analiza powtórzeń mikrosatelitarnych (SSR). Obecnie ta metoda jest szeroko stosowana do izolowania linii klonalnych. Do analizy szczepów szeroko stosowano (i nadal używa się) takie cechy markera fenotypowego, jak obecność genów wirulencji odmian ziemniaka (Avdey, 1995, Ivanyuk i in., 2002, Ulanova i in., 2003). Do tej pory geny wirulencji odmian ziemniaka straciły swoją wartość jako cech markerowych w badaniach populacyjnych z powodu pojawienia się maksymalnej (lub zbliżonej do niej) liczby genów wirulencji w zdecydowanej większości izolatów. Jednocześnie gen wirulencji T1 dla odmian pomidora niosących odpowiedni gen Ph1 jest nadal z powodzeniem stosowany jako cecha markerowa (Lavrova i wsp., 2003; Ulanova i wsp., 2003).
W wielu pracach jako marker stosuje się odporność na fungicydy. Ta cecha jest niepożądana do stosowania w badaniach populacyjnych ze względu na dość łatwe pojawienie się mutacji oporności w liniach klonalnych po zastosowaniu w terenie fungicydów zawierających metalaksyl (lub mefenoksam). Na przykład istotne różnice w poziomie oporności zostały wykazane w obrębie linii klonalnej Sib1 (Elansky et al., 2001).
Zatem typ kojarzenia, widmo izozymów peptydazy, typ mitochondrialnego DNA, RFLP-RG57, SSR są preferowanymi markerami do tworzenia banków danych i znakowania szczepów w kolekcjach. Aby porównać ograniczone próbki, jeśli konieczne jest użycie maksymalnej liczby cech markera, można użyć AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (Tabela 5). Należy jednak pamiętać, że metody te są mało powtarzalne iw każdym indywidualnym doświadczeniu (cykl amplifikacji i elektroforezy) konieczne jest użycie kilku izolatów referencyjnych.
Tabela 5. Porównanie różnych metod badania szczepów P. infestans
kryterium | TC | Gliniarze z Isofer | MtDNA | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | Obrót silnika |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Ilość informacji | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Odtwarzalność | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Możliwość artefaktów | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Kosztować | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Intensywność pracy | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Szybkość analizy ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Uwaga: H - niski, C - średni, B - wysoki; НС * - pracochłonność jest niska przy stosowaniu żelu agarozowego lub automatycznego
genotyper, medium - przez destylację w żelu poliakrylamidowym z wyznakowanymi primerami,
** - nie licząc czasu spędzonego na hodowli grzybni w celu izolacji DNA.
Struktura ludności
Linie klonalne
W przypadku braku rekombinacji lub jej niewielkiego wkładu w strukturę populacji populacja składa się z pewnej liczby klonów, między którymi wymiany genetyczne są niezwykle rzadkie.
W takich populacjach bardziej pouczające jest badanie nie częstotliwości poszczególnych genów, ale częstości genotypów, które mają wspólne pochodzenie (linie klonalne lub linie klonalne) i różnią się jedynie mutacjami punktowymi. Badania populacyjne patogenu zarazy i analiza linii klonalnych uległy znacznemu przyspieszeniu od czasu pojawienia się metody RFLP-RG57 na początku lat 90. ubiegłego wieku. Wraz z RFLP-RG57, typ kojarzenia, widma izoenzymów peptydazy i izomerazy glukozo-6-fosforanowej oraz typ mitochondrialnego DNA są wykorzystywane do identyfikacji linii klonalnych. Charakterystykę najczęstszych linii klonalnych przedstawiono w tabeli 6.
Klon US-1 zdominował populacje do końca lat 80. XX wieku, po czym zaczął być zastępowany przez inne klony i zniknął z Europy i Ameryki Północnej. Obecnie występuje na Dalekim Wschodzie (Filipiny, Tajwan, Chiny, Japonia, Korea, Koh i in., 1994, Mosa i in., 1993), w Afryce (Uganda, Kenia, Rwanda, Goodwin et al, 1994, Vega-Sanchez et al. in., 2000; Ochwo i in., 2002) oraz w Ameryce Południowej (Ekwador, Brazylia, Peru, Forbes i in., 1997, Goodwin i in., 1994). W samej Australii nie zidentyfikowano żadnych szczepów należących do linii US-1. Najwyraźniej izolaty P. infestans przybyły do Australii z kolejną falą migracji (Goodwin, 1997).
Klon US-6 wyemigrował z północnego Meksyku do Kalifornii pod koniec lat 70. XX wieku i wywołał tam epidemię ziemniaków i pomidorów po 32 latach bez choroby. Ze względu na swoją wysoką agresywność wyparł klon US-1 i zaczął dominować na zachodnim wybrzeżu Stanów Zjednoczonych (Goodwin i in., 1995a).
Genotypy US-7 i US-8 odkryto w Stanach Zjednoczonych w 1992 r., A już w 1994 r. Były szeroko rozpowszechnione w Stanach Zjednoczonych i Kanadzie. W ciągu jednego sezonu polowego klon US-8 jest w stanie prawie całkowicie wyprzeć klon US-1 na poletkach ziemniaczanych początkowo zakażonych obydwoma klonami w jednakowym stężeniu (Miller i Johnson, 2000).
Klony BC-1 do BC-4 zidentyfikowano w Kolumbii Brytyjskiej w niewielkiej liczbie izolatów z Goodwin i wsp., 1995b). Klon US-11 rozprzestrzenił się szeroko w Stanach Zjednoczonych i wyparł US-1 na Tajwanie. Klony JP-1 i EC-1, wraz z klonem US-1, są powszechne odpowiednio w Japonii i Ekwadorze (Koh i wsp., 1994; Forbes i wsp., 1997).
SIB-1 to klon, który dominował w Rosji na rozległym terytorium od obwodu moskiewskiego po Sachalin. W rejonie moskiewskim został odkryty w 1993 roku, a niektóre populacje terenowe składały się głównie z szczepów tej linii klonalnej, wysoce odpornych na metalaksyl. Po 1993 roku częstość występowania tego klonu znacznie się zmniejszyła. Poza Uralem w latach 1997-1998 SIB-1 znaleziono wszędzie, z wyjątkiem Terytorium Chabarowskiego (klon SIB-2 jest tam szeroko rozpowszechniony). Przestrzenne oddzielenie klonów o różnych typach kojarzenia wyklucza proces płciowy na Syberii i na Dalekim Wschodzie. W regionie moskiewskim, w przeciwieństwie do Syberii, ludność reprezentowana jest przez wiele klonów; prawie każdy izolat ma unikalny genotyp multilocus (Elansky et al., 2001, 2015). Różnorodności tej nie można wytłumaczyć wyłącznie importem szczepów grzyba z różnych części świata wraz z importowanym materiałem siewnym. Ponieważ w populacji występują oba typy kojarzeń, możliwe jest, że jej różnorodność wynika również z rekombinacji. Zatem w Kolumbii Brytyjskiej zakłada się pojawienie się genotypów BC-2, BC-3 i BC-4 w wyniku hybrydyzacji klonów BC-1 i US-6 (Goodwin i wsp., 1995b). Możliwe, że szczepy hybrydowe występują w populacjach Moskwy. Na przykład szczepy MO-4, MO-8 i MO-11 heterozygotyczne pod względem locus PEP mogą być hybrydami między szczepami MO-12, MO-21, MO-22, mającymi typ kojarzenia A2 i homozygotycznymi pod względem jednego allelu locus PEP i szczepu MO-8, posiadający typ kojarzenia A1 i homozygotyczny dla innego allelu tego locus. A jeśli tak jest, a we współczesnych populacjach P. infestans istnieje tendencja do wzrostu roli procesu płciowego, to wartość informacyjna analizy klonów multilocus będzie spadać (Elansky i in., 2001, 2015).
Zmienność w liniach klonalnych
Do lat 90-tych XX wieku linia klonalna US-20 była szeroko rozpowszechniona na świecie. Większość populacji terenowych i regionalnych składała się wyłącznie ze szczepów o genotypie US-1. Zaobserwowano jednak również różnice między izolatami, najprawdopodobniej spowodowane procesem mutacji. Mutacje wystąpiły zarówno w DNA jądrowym, jak i mitochondrialnym i wpływały między innymi na poziom oporności na leki fenyloamidowe oraz liczbę genów wirulencji. Linie, które różnią się mutacjami od oryginalnych genotypów, oznaczono dodatkowymi liczbami po kropce po nazwie oryginalnego genotypu (na przykład zmutowana linia US-1 z linii klonalnej US-1.1). Linie DNA do pobierania odcisków palców US-1 i US-1.5 zawierają linie pomocnicze o różnych rozmiarach (Goodwin i wsp., 1.6a, 1995b); linia klonalna US-1995 także różni się od US-6.3 jedną linią pomocniczą (Goodwin, 6, Tabela 1997).
Podczas badania DNA mitochondrialnego stwierdzono, że tylko mitochondrialne DNA typu 1b znajduje się w linii klonalnej US-1 (Carter i wsp., 1990). Jednak w badaniu szczepów tej linii klonalnej z Peru i Filipin znaleziono izolaty, których typy mitochondrialnego DNA różniły się od 1b obecnością insercji i delecji (Goodwin, 1991, Koh i in., 1994).
Tabela 6. Genotypy multilocus niektórych linii klonalnych P. infestans
Nazwa | Typ krycia | Izzymy | Odciski palców DNA | Typ MtDNA | |
GPI | PEP | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011E + 24 | Ib |
US-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011E + 24 | - |
US-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011E + 24 | IIb |
US-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
US-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
US-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIb |
US-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | - |
US-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011E + 24 | - |
US-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011E + 24 | - |
US-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011E + 24 | - |
US-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
EC-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011E + 24 | IIa |
SYB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
SYB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
SYB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011E + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011E + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011E + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011E + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011E + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011E + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011E + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011E + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011E + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011E + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
Uwaga: * - brak danych.
Tabela 7. Genotypy Multilocus i ich zmutowane linie
Nazwa | Typ krycia | | Odciski palców DNA (RG57) | Uwagi | |
GPI | PEP-1 | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Oryginalny genotyp 1 |
US-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutacja w PEP |
US-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutacja w RG57 |
US-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutacja w RG57 |
US-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutacja w RG57 i PEP |
US-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutacja w RG57 |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Oryginalny genotyp 2 |
US-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutacja w PEP |
US-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutacja w RG57 |
US-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutacja w RG57 |
US-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutacja w RG57 i PEP |
US-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutacja w RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Oryginalny genotyp 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutacja w RG57 |
Zachodzą również zmiany w widmach izozymów. Z reguły są spowodowane rozpadem organizmu początkowo heterozygotycznego dla tego enzymu na organizm homozygotyczny. W 1993 roku na owocach pomidora zidentyfikowaliśmy szczep o charakterystyce typowej dla US-1: odciski palców RG57, typ DNA mitochondrialnego i genotyp 86/100 dla izomerazy glukozo-6-fosfatyna, ale był on homozygotyczny (100/100) dla pierwszego locus peptydazy zamiast heterozygotą 92/100 typową dla tej linii klonalnej. Nazwaliśmy genotyp tego szczepu MO-17 (Tabela 6). Zmutowane linie US-1.1 i US-1.4 także różnią się od US-1 mutacjami w pierwszym locus peptydazy (Tabela 7).
Mutacje prowadzące do zmian w liczbie genów wirulencji odmian ziemniaka i pomidora są dość powszechne. Zostały odnotowane wśród izolatów linii klonalnej US-1 w populacjach z Holandii (Drenth et al., 1994), Peru (Goodwin et al., 1995a), Polski (Sujkowski et al., 1991), północnej Ameryki Północnej (Goodwin et al., ., 1995b). Różnice w liczbie genów wirulencji ziemniaka odnotowano także wśród izolatów linii klonalnych US-7 i US-8 w Kanadzie i Stanach Zjednoczonych (Goodwin i in., 1995a), wśród izolatów linii SIB-1 w azjatyckiej części Rosji (Elansky i in., 2001 ).
Izolaty z silnymi różnicami w poziomach oporności na leki fenyloamidowe zidentyfikowano w populacjach monoklonalnych terenowych, z których wszystkie należały do linii klonalnej Sib-1 (Elansky i wsp., 2001, Tabela 1). Prawie wszystkie szczepy z linii klonalnej US-1 są bardzo wrażliwe na metalaksyl, jednak wysoce oporne izolaty tej linii wyizolowano na Filipinach (Koh i wsp., 1994) oraz w Irlandii (Goodwin i wsp., 1996).
Współczesne populacje P. infestans
Ameryka Środkowa (Meksyk)
Populacja P. infestans w Meksyku znacznie różni się od innych populacji świata, co wynika przede wszystkim z jej historycznego położenia. Liczne badania tej populacji i pokrewnych gatunków P. infestans z kladu Phytophthora, a także lokalnych gatunków z rodzaju Solanum, doprowadziły do wniosku, że ewolucja patogenu w środkowej części Meksyku następowała wraz z ewolucją roślin żywicielskich i była związana z rekombinacją płciową (Grünwald, Flier , 2005). Oba typy krycia są reprezentowane w populacji i w równych proporcjach, a obecność oosporów w glebie, na roślinach i bulwach ziemniaków oraz dziko rosnących gatunkach pokrewnych Solanum potwierdza obecność procesu płciowego w populacji (Fernández-Pavía et al., 2002). Niedawne badania Doliny Toluca i jej okolic (domniemanego ośrodka pochodzenia patogenu) potwierdziły duże zróżnicowanie genetyczne lokalnej populacji P. infestans (134 genotypy multilocus w próbie 176 próbek) oraz występowanie w regionie kilku zróżnicowanych subpopulacji (Wang i in., 2017). Czynniki przyczyniające się do tego zróżnicowania to przestrzenny podział subpopulacji charakterystyczny dla wyżyn środkowego Meksyku, różnice w warunkach uprawy i odmian ziemniaków stosowanych w dolinach i górach oraz obecność dzikich bulwiastych gatunków Solanum, które mogą pełnić rolę żywicieli alternatywnych (Fry et al. ., 2009).
Należy jednak zauważyć, że populacje P. infestans w północnym Meksyku są raczej klonalne i bardziej podobne do populacji północnoamerykańskich, co może wskazywać, że są to nowe genotypy (Fry i in., 2009).
Ameryka Północna
Populacje P. infestans w Ameryce Północnej zawsze miały bardzo prostą strukturę, a ich charakter klonalny ustalono na długo przed zastosowaniem analizy mikrosatelitarnej. Do 1987 roku w Stanach Zjednoczonych i Kanadzie dominowała linia klonalna US-1 (Goodwin i wsp., 1995). W połowie lat siedemdziesiątych XX wieku, kiedy pojawiły się fungicydy na bazie metalaksylu, klon ten zaczął być zastępowany innymi, bardziej odpornymi genotypami, które migrowały z Meksyku (Goodwin i wsp., 70). Pod koniec lat 1998. genotyp US-90 całkowicie zastąpił genotyp US-8 w Stanach Zjednoczonych i stał się dominującą linią klonalną na ziemniakach (Fry i in., 1; Fry i in., 2009). Inaczej sytuacja wyglądała w przypadku pomidorów, które stale zawierały kilka linii klonalnych, a ich skład zmieniał się z roku na rok (Fry i in., 2015).
W 2009 roku na pomidorach w Stanach Zjednoczonych wybuchła wielka epidemia zarazy. Cechą tej pandemii był jej niemal równoczesny początek w wielu miejscach północno-wschodnich Stanów Zjednoczonych, co okazało się związane z masową sprzedażą porażonych sadzonek pomidorów w dużych centrach ogrodniczych (Fry i in., 2013). Straty w plonach były ogromne. Analiza mikrosatelitarna pobranych próbek wykazała, że szczep pandemiczny należał do krycia typu A22 linii klonalnej US-2. W 2009 roku udział tego genotypu w amerykańskiej populacji P. infestans sięgnął 80% (Fry i in., 2013). W kolejnych latach udział agresywnych genotypów US-23 (głównie na pomidorach) i US-24 (na ziemniakach) systematycznie wzrastał w populacji, jednak po 2011 roku wskaźnik wykrywalności US-24 znacznie spadł i do tej pory około 90% populacji patogenu w Stany Zjednoczone są reprezentowane przez genotyp US-23 (Fry i in., 2015).
W Kanadzie, podobnie jak w Stanach Zjednoczonych, pod koniec lat 90. dominujący genotyp US-1 został wyparty przez US-8, którego dominująca pozycja pozostała niezmieniona do 2008 roku. W latach 2009-2010. W Kanadzie wystąpiły poważne epidemie zarazy związane ze sprzedażą zainfekowanych sadzonek pomidorów, ale były one spowodowane genotypami US-23 i US-8 (Kalischuk i in., 2012). Wyraźne zróżnicowanie geograficzne tych genotypów było niezwykłe: US-23 zdominował zachodnie prowincje Kanady (68%), podczas gdy US-8 zdominował wschodnie prowincje (83%). W kolejnych latach US-23 rozprzestrzenił się na rejony wschodnie, jednak generalnie jego udział w populacji nieznacznie spadł na tle pojawienia się w kraju genotypów US-22 i US-24 (Peters i in., 2014). Do chwili obecnej US-23 utrzymuje dominującą pozycję w całej Kanadzie; US-8 występuje w Kolumbii Brytyjskiej, podczas gdy US-23 i US-24 są obecne w Ontario (Peters, 2017).
Zatem populacje P. infestans w Ameryce Północnej to głównie linie klonalne. W ciągu ostatnich 40 lat liczba wykrytych genotypów klonalnych osiągnęła 24. Pomimo faktu, że w populacji obecne są szczepy obu typów kojarzenia, prawdopodobieństwo pojawienia się nowych genotypów w wyniku rekombinacji płciowej pozostaje dość niskie. Niemniej jednak w ciągu ostatnich 20 lat odnotowano kilka przypadków pojawienia się efemerycznych populacji rekombinowanych (Gavino i in., 2000; Danies i in., 2014; Peters i in., 2014), aw jednym przypadku wynikiem krzyżowania był genotyp US-11 , który przez wiele lat był zakorzeniony w Ameryce Północnej (Gavino i in., 2000). Do 2009 roku zmiany w strukturze populacji wiązały się z pojawieniem się nowych, bardziej agresywnych genotypów z ich późniejszą migracją i wypieraniem wcześniej dominujących poprzedników. Co wydarzyło się w latach 2009-2010 w USA i Kanadzie epifitotyka po raz pierwszy pokazała, że w dobie globalizacji wybuchy choroby można wiązać z aktywnym rozprzestrzenianiem się nowych genotypów przy sprzedaży zakażonego materiału nasadzeniowego.
Ameryka Południowa
Do niedawna badania populacji P. infestans w Ameryce Południowej nie były ani regularne, ani prowadzone na dużą skalę. Wiadomo, że struktura tych populacji jest dość prosta i obejmuje 1-5 linii klonalnych na kraj (Forbes i in., 1998). Tak więc do 1998 r. Genotypy US-1 (Brazylia, Chile) BR-1 (Brazylia, Boliwia, Urugwaj, Paragwaj), EC-1 (Ekwador, Kolumbia, Peru i Wenezuela), AR-1, AR znaleziono na ziemniakach -2, AR-3, AR-4 i AR-5 (Argentyna), PE-3 i PE-7 (południowe Peru). Typ krycia A2 był obecny w Brazylii, Boliwii i Argentynie i nie został znaleziony poza granicą boliwijsko-peruwiańską w rejonie jeziora Titicaca, za którym w Andach dominował genotyp EC-1 A1. W przypadku pomidorów US-1 pozostał dominującym genotypem w całej Ameryce Południowej.
Sytuacja utrzymywała się mniej więcej w pierwszej dekadzie XXI wieku. Ważnym punktem było odkrycie nowej linii klonalnej EC-2000 typu A2 na dzikich krewnych ziemniaków (S. brevifolium i S. tetrapetalum) w północnych Andach (Oliva et al., 2). Badania filogenetyczne wykazały, że linia ta nie jest całkowicie identyczna z P. infestans, chociaż jest z nią blisko spokrewniona, w związku z tym zaproponowano rozważenie jej, podobnie jak innej linii EC-2010, wyizolowanej z pomidora S. betaceum rosnącego w Andach, nowy gatunek o nazwie P. andina; jednak status tego gatunku (gatunek niezależny lub hybryda P. infestans z pewną wciąż nieznaną linią) jest nadal niejasny (Delgado i in., 3).
Obecnie wszystkie południowoamerykańskie populacje P. infestans są klonalne. Pomimo obecności obu typów kojarzeń, nie zidentyfikowano rekombinowanych populacji. W przypadku pomidorów genotyp US-1 jest wszechobecny, najwyraźniej wyparty z ziemniaków przez lokalne odmiany, których dokładne pochodzenie jest nadal nieznane. W Brazylii, Boliwii i Urugwaju obecny jest genotyp BR-1; w Peru, obok US-1 i EC-1, istnieje kilka innych lokalnych genotypów. W Andach dominującą pozycję utrzymuje linia klonalna EC-1, której pokrewieństwo z niedawno odkrytą P. andina pozostaje niezbadane. Jedyne „niestabilne” miejsce, w którym za lata 2003-2013. nastąpiły znaczące zmiany w populacji, stało się Chile (Acuña i in., 2012), gdzie w latach 2004-2005. populacja patogenów została scharakteryzowana przez oporność na metalaksyl i nowy haplotyp mitochondrialnego DNA (Ia zamiast wcześniej obecnego Ib). 2006 do 2011 W populacji dominował genotyp 21 (wg SSR), którego udział sięgał 90%, po czym palma przeszła do genotypu 20, którego częstość występowania w kolejnych dwóch latach utrzymywała się na poziomie około 67% (Acuña, 2015).
Europa
W historii Europy miały miejsce co najmniej dwie fale migracji P. infestans z Ameryki Północnej: w XIX wieku. (HERB-1) i początek XX wieku (US-1). Wszechobecna dystrybucja fungicydów zawierających metalaksyl w latach 70. doprowadziło do zastąpienia dominującego genotypu US-1 i zastąpienia go nowymi genotypami. W rezultacie w większości krajów Europy Zachodniej populacje patogenu reprezentowane były głównie przez kilka linii klonalnych.
Zastosowanie analizy mikrosatelitarnej do analizy populacji patogenów pozwoliło na ujawnienie poważnych zmian, które zaszły w Europie Zachodniej w latach 2005-2008. W 2005 roku odkryto w Wielkiej Brytanii nową linię klonalną, nazwaną 13_A2 (lub „Blue 13”) i charakteryzującą się typem krycia A2. , wysoka agresywność i odporność na fenyloamidy (Shaw i in., 2007). Ten sam genotyp znaleziono w próbkach pobranych w 2004 r. W Holandii i północnej Francji, co sugerowało, że migrował do Wielkiej Brytanii z Europy kontynentalnej, prawdopodobnie z sadzeniakami (Cooke i in., 2007). Badanie genomu przedstawicieli tej linii klonalnej wykazało wysoki stopień polimorfizmu jej sekwencji (do 2016 r. Liczba jej odmian subklonalnych sięgnęła 340) oraz znaczny stopień zróżnicowania poziomu ekspresji genów, m.in. geny efektorowe podczas infekcji roślin (Cooke i in., 2012; Cooke, 2017). Cechy te, wraz z wydłużeniem czasu trwania fazy biotroficznej, mogą powodować zwiększoną agresywność 13_A2 i jego zdolność do infekowania nawet odmian ziemniaka odpornych na zarazę.
W ciągu następnych kilku lat genotyp szybko rozprzestrzenił się w krajach Europy Północno-Zachodniej (Wielka Brytania, Irlandia, Francja, Belgia, Holandia, Niemcy) z jednoczesnym wypieraniem wcześniej dominujących genotypów 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry et al., 2010; Gisi et al. , 2011; Van den Bosch i in., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Według strony internetowej www.euroblight.net, udział 13_A2 w populacji tych krajów sięgał 60-80% i więcej; obecność tego genotypu odnotowano również w niektórych krajach Europy Wschodniej i Południowej. Jednak w latach 2009-2012. 13_A2 utraciło dominujące pozycje w Wielkiej Brytanii i Francji ustępując linii 6_A1 (8_A1 w Irlandii), aw Holandii i Belgii zostało częściowo zastąpione przez genotypy 1_A1, 6_A1 i 33_A2 (Cooke i in., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Do chwili obecnej około 70% populacji P. infestans w Europie Zachodniej to osoby monoklonalne. Według serwisu www.euroblight.net dominujące genotypy w krajach Europy Północno-Zachodniej (Wielka Brytania, Francja,
Holandia, Belgia) pozostają w przybliżeniu w równych proporcjach 13_A2 i 6_A1, ten ostatni praktycznie nie występuje poza określonym regionem (z wyjątkiem Irlandii), ale ma już co najmniej 58 subklonów (Cooke, 2017). Odmiany 13_A2 są zauważalne liczebnie w Niemczech, sporadycznie są też obserwowane w krajach Europy Środkowej i Południowej. Genotyp 1_A1 stanowi znaczną część populacji Belgii oraz częściowo Holandii i Francji. Genotyp 8_A1 ustabilizował się w populacji europejskiej na poziomie 3-6%, z wyjątkiem Irlandii, gdzie utrzymuje pozycję lidera i dzieli się na dwa subklony (Stellingwerf, 2017). Wreszcie w 2016 r. Odnotowano wzrost częstości występowania nowych genotypów 36_A2 i 37_A2, które po raz pierwszy odnotowano w latach 2013–2014; do tej pory te genotypy występują w Holandii i Belgii oraz częściowo we Francji i Niemczech, a także w południowej części Wielkiej Brytanii (Cooke, 2017). Około 20-30% populacji Europy Zachodniej jest reprezentowanych każdego roku przez unikalne genotypy.
W przeciwieństwie do Europy Zachodniej, do czasu pojawienia się genotypu 13_A2, populacje Europy Północnej (Szwecja, Norwegia, Dania, Finlandia) były reprezentowane nie przez linie klonalne, ale przez dużą liczbę unikalnych genotypów (Brurberg et al.,
2011). W okresie aktywnego rozprzestrzeniania się 13_A2 w Europie Zachodniej, obecność tego genotypu w Skandynawii odnotowano dopiero w 2011 roku, kiedy to po raz pierwszy odkryto go w Północnej Jutlandii (Dania), gdzie uprawiane są głównie przemysłowe odmiany ziemniaków przy aktywnym użyciu zawierających metalaksyl fungicydy (Nielsen i in., 2014). Według www.euroblight.net genotyp 13_A2 wykryto również w kilku próbkach z Norwegii i Danii w 2014 r. Oraz w kilku próbkach norweskich w 2016 r .; ponadto w 2013 roku w Finlandii odnotowano obecność genotypu 6_A1 w niewielkiej ilości. Za główną przyczynę niepowodzenia 13_A2 i innych linii klonalnych w podboju Skandynawii uważa się różnice klimatyczne tego regionu od krajów Europy Zachodniej.
Oprócz tego, że chłodne lata i mroźne zimy sprzyjają przetrwaniu nie tyle wegetatywnej grzybni, ile oospor (Sjöholm et al., 2013), zamarzanie gleby w zimie (co zwykle nie występuje w cieplejszych krajach Europy Zachodniej) przyczynia się do synchronizacji kiełkowania i sadzenia oospor. ziemniak, co wzmacnia ich rolę jako źródła pierwotnej infekcji (Brurberg i in., 2011). Należy również zauważyć, że na północy rozwój infekcji oospor wyprzedza rozwój infekcji bulwiastej, co ostatecznie zapobiega dominacji jeszcze bardziej agresywnych, ale później rozwiniętych linii klonalnych (Yuen, 2012). Struktura najczęściej badanych populacji P. infestans w krajach Europy Wschodniej (Polska, kraje bałtyckie) jest bardzo podobna do tej w Skandynawii.
Występują tu również oba typy kojarzeń, a zdecydowana większość genotypów określonych analizą SSR jest unikatowa (Chmielarz i in., 2014; Runno-Paurson i in., 2016). Podobnie jak w Europie Północnej rozmieszczenie linii klonalnych (głównie genotypu 13_A2) praktycznie nie wpłynęło na lokalne populacje patogenu, które zachowują wysoki poziom różnorodności przy braku wyraźnych linii dominujących.
Obecność 13_A2 jest sporadycznie obserwowana na polach z handlowymi odmianami ziemniaków. W Rosji sytuacja rozwija się w podobny sposób. Analiza mikrosatelitarna izolatów P. infestans zebranych w latach 2008-2011 w 10 różnych regionach europejskiej części Rosji wykazał wysoki stopień różnorodności genotypowej i całkowity brak zbieżności z europejskimi liniami klonalnymi (Statsyuk i in., 2014). Kilka lat później, badanie próbek P. infestans zebranych w regionie Leningradu w latach 2013-2014 wykazało istotne różnice między nimi a genotypami z tego regionu zidentyfikowanymi w poprzednim badaniu. W obu badaniach nie znaleziono zachodnioeuropejskich genotypów (Beketova i in., 2014; Kuznetsova i in., 2016).
Duża różnorodność genetyczna wschodnioeuropejskich populacji P. infestans i brak w nich dominujących linii klonalnych może wynikać z kilku powodów. Po pierwsze, podobnie jak w Europie Północnej, warunki klimatyczne badanych krajów przyczyniają się do powstawania oospor jako głównego źródła zakażenia (Ulanova i in., 2010; Chmielarz i in., 2014). Po drugie, znaczna część ziemniaków produkowanych w tych krajach jest uprawiana w małych prywatnych gospodarstwach, często otoczonych lasami lub innymi przeszkodami w swobodnym przepływie materiału zakaźnego (Chmielarz i in., 2014). Z reguły ziemniaki uprawiane w takich warunkach praktycznie nie są poddawane obróbce chemicznej, a wybór odmian opiera się na ich odporności na zarazę, tj. nie ma selektywnej presji na agresywność i odporność na metalaksyl, co pozbawia oporne genotypy, takie jak 13_A2, przewagi nad innymi genotypami (Chmielarz i in., 2014). Wreszcie, ze względu na niewielki rozmiar działek, ich właściciele zwykle nie praktykują płodozmianu, uprawiając ziemniaki w tym samym miejscu przez lata, co przyczynia się do akumulacji genetycznie zróżnicowanego inokulum (Runno-Paurson i in., 2016; Elansky, 2015; Elansky i in. ., 2015).
Azja
Do niedawna struktura populacji P. infestans w Azji pozostawała stosunkowo słabo poznana. Wiadomo było, że jest reprezentowany głównie przez linie klonalne, a wpływ rekombinacji płciowej na powstawanie nowych genotypów jest bardzo mały. Na przykład w latach 1997-1998. W azjatyckiej części Rosji (Syberia i Daleki Wschód) populację patogenów reprezentowały tylko trzy genotypy z przewagą genotypu SIB-1 (Elansky i in., 2001). Obecność klonalnych linii patogenów wykazano w krajach takich jak Chiny, Japonia, Korea, Filipiny i Tajwan (Koh i in., 1994; Chen i in., 2009). Linia klonalna US-1 dominowała na dużym terytorium Azji pod koniec lat 90-tych i na początku XXI wieku. prawie wszędzie zaczęto zastępować inne genotypy, które z kolei ustąpiły miejsca nowym. W większości przypadków zmiany w strukturze i składzie populacji w krajach azjatyckich wiązały się z migracją nowych genotypów z zewnątrz. Tak więc w Japonii, z wyjątkiem genotypu JP-2000, wszystkie inne japońskie genotypy, które pojawiły się po US-3 (JP-1, JP-1, JP-2) mają mniej lub bardziej udowodnione pochodzenie zewnętrzne (Akino et al., 3) ... Obecnie w Chinach występują trzy główne populacje patogenów z wyraźnym podziałem geograficznym; Pomiędzy tymi populacjami nie ma lub jest bardzo słaby przepływ genów (Guo i in., 2011; Li i in., 2010b). Genotyp 2013_A13 pojawił się na terenie Chin w ich południowych prowincjach (Junnan i Syczuan) w latach 2-2005 oraz 2007-2012. obserwowano również w północno-wschodniej części kraju (Li i in., 1014b). W Indiach 2013_A13 pojawiło się przypuszczalnie w tym samym czasie co w Chinach, najprawdopodobniej z zakażonymi sadzeniakami (Chowdappa et al., 2) oraz w latach 2015-2009. spowodował poważną epifitotyczną chorobę zarazy ziemniaczanej pomidora na południu kraju, po czym rozprzestrzeniła się na ziemniaki iw 2010 roku wywołała wybuch zarazy w Bengalu Zachodnim, co doprowadziło do ruiny i samobójstw wielu lokalnych rolników (Fry, 2014).
Африка
Do 2008-2010 roku nie prowadzono systematycznych badań P. infestans w krajach afrykańskich. W tej chwili afrykańskie populacje P. infestans można podzielić na dwie grupy, a podział ten jest wyraźnie związany z faktem importu sadzeniaków z Europy.
W Afryce Północnej, która aktywnie importuje sadzeniaki z Europy, typ krycia A2 jest szeroko reprezentowany w prawie wszystkich regionach, co daje teoretyczną możliwość pojawienia się nowych genotypów w wyniku rekombinacji płciowej (Corbière i in., 2010; Rekad i in., 2017). Ponadto w Algierii obserwuje się obecność genotypów 13_A2, 2_A1 i 23_A1 z wyraźną dominacją pierwszego z nich, a także stopniowym zmniejszaniem się odsetka unikalnych genotypów do całkowitego zaniku (Rekad i in., 2017). W przeciwieństwie do pozostałej części regionu, w Tunezji (z wyjątkiem północno-wschodniej części kraju) populację patogenu reprezentuje głównie typ krycia A1 (Harbaoui i in., 2014).
Dominuje tu klonalna linia NA-01. Ogólnie udział linii klonalnych w populacji wynosi tylko 43%. W Afryce Wschodniej i Południowej, gdzie wielkość importu nasion jest znikomo mała (Fry i in., 2009), P. infestans jest reprezentowany tylko przez dwie klonalne linie typu A1, US-1 i KE-1, przy czym ta ostatnia aktywnie zastępuje tę pierwszą na ziemniakach ( Pule i in., 2012; Njoroge i in., 2016). Do chwili obecnej oba te genotypy mają zauważalną liczbę odmian subklonalnych.
Australia
Pierwsze doniesienia o zarazy ziemniaków w Australii pochodzą z 1907 r., A pierwsza epifitacja, prawdopodobnie spowodowana ulewnymi deszczami w miesiącach letnich, miała miejsce w latach 1909–1911. (Drenth i in., 2002). Generalnie jednak zaraza późna nie ma znaczącego znaczenia gospodarczego dla kraju. Sporadyczne ogniska zarazy, wywołane warunkami pogodowymi zapewniającymi wysoką wilgotność, nie występują częściej niż raz na 5-7 lat i są zlokalizowane głównie w północnej Tasmanii i środkowej Wiktorii. W związku z powyższym praktycznie nie ma publikacji poświęconych badaniu struktury australijskiej populacji P. infestans. Najnowsze dostępne informacje pochodzą z lat 1998-2000. (Drenth i in., 2002). Według autorów populacja stanu Victoria była klonalną linią US-1.3, co pośrednio potwierdziło migrację tego genotypu ze Stanów Zjednoczonych. Okazy tasmańskie zostały sklasyfikowane jako AU-3, różniące się od genotypów występujących w tym czasie w innych częściach świata.
Cechy rozwoju zarazy w Rosji
W Europie infekcja wprowadzona przez chore bulwy nasienne, oospory, które zimowały w glebie, a także zoosporangia przenoszona przez wiatr z roślin wyhodowanych z zimujących bulw na ubiegłorocznych polach (rośliny „samosiewne”) lub na stosach ubitych zakładka do przechowywania bulw. Spośród nich za najniebezpieczniejsze źródło infekcji uważa się rośliny wyhodowane na stosach odrzuconych bulw. tam liczba porośniętych bulw jest często znaczna, a zoosporangia może być z nich przenoszona na duże odległości. Reszta źródeł (oospory, rośliny „samosiewne”) nie jest tak niebezpieczna, ponieważ nie jest zwyczajowo uprawiać rośliny na tych samych polach częściej niż raz na 3-4 lata. Zakażenie przez chore bulwy nasion jest również minimalne ze względu na dobry system kontroli jakości nasion.
Ogólnie rzecz biorąc, ilość inokulum w populacjach europejskich jest ograniczona, a zatem wzrost epidemii jest dość powolny i można go z powodzeniem kontrolować za pomocą chemicznych preparatów grzybobójczych. Głównym zadaniem w warunkach europejskich jest walka z infekcją w fazie, w której rozpoczyna się masowe rozprzestrzenianie się zoosporangii z porażonych roślin.
W Rosji sytuacja jest radykalnie inna. Większość upraw ziemniaków i pomidorów jest uprawiana w małych prywatnych ogrodach; środki ochronne albo w ogóle nie są na nich wykonywane, albo zabiegi grzybobójcze przeprowadza się w niewystarczającej liczbie i rozpoczynają się po pojawieniu się zarazy na wierzchołkach. W rezultacie głównym źródłem infekcji są prywatne ogrody warzywne, z których zoosporangia są przenoszone przez wiatr na nasadzenia komercyjne. Potwierdzają to nasze bezpośrednie obserwacje w Moskwie, Briańsku, Kostromie, Riazaniu: uszkodzenia roślin w prywatnych ogrodach obserwuje się jeszcze przed rozpoczęciem zabiegów fungicydowych na nasadzeniach komercyjnych. Następnie epidemię na dużych polach powstrzymuje stosowanie preparatów grzybobójczych, natomiast w ogrodach prywatnych następuje szybki rozwój zarazy.
W przypadku niewłaściwych lub „budżetowych” zabiegów nasadzeń komercyjnych na polach pojawiają się również ogniska zarazy; później aktywnie się rozwijają, obejmując coraz większe obszary (Elansky, 2015). Infekcja w ogrodach prywatnych ma znaczący wpływ na epidemie na polach komercyjnych. We wszystkich regionach uprawy ziemniaków w Rosji powierzchnia zajmowana przez ziemniaki w prywatnych ogrodach jest kilkakrotnie większa niż łączna powierzchnia pól dużych producentów. W takim środowisku prywatne ogrody warzywne można postrzegać jako globalne źródło inokulum dla pól komercyjnych. Spróbujmy zidentyfikować te właściwości, które są charakterystyczne dla genotypów odmian w prywatnych ogrodach.
Sadzenie innych niż nasiona i kontrola kwarantannowa ziemniaków jadalnych, nasion pomidora pochodzących od podejrzanych zagranicznych producentów, wieloletnia uprawa ziemniaków i pomidorów na tych samych obszarach, niewłaściwe zabiegi fungicydowe lub ich całkowity brak prowadzą do poważnych epifitotii w sektorze prywatnym, których wynik jest wolny krzyżowanie, hybrydyzacja i tworzenie oosporów w prywatnych ogrodach. W efekcie obserwuje się bardzo dużą różnorodność genotypową patogenu, gdy prawie każdy szczep jest unikalny pod względem genotypu (Elansky i in., 2001, 2015). Sadzenie sadzeniaków o różnym pochodzeniu genetycznym sprawia, że jest mało prawdopodobne, aby pojawiały się linie klonalne wyspecjalizowane w atakowaniu określonej odmiany. Wyselekcjonowane w takim przypadku szczepy wyróżniają się wszechstronnością w stosunku do dotkniętych odmian, większość z nich posiada bliską maksymalnej liczbie genów wirulencji. Różni się to bardzo od systemu „linii klonalnych” typowego dla dużych pól przedsiębiorstw rolniczych z prawidłowo zainstalowanym systemem ochrony przed zarazą. „Linie klonalne” (gdy wszystkie szczepy patogenu zarazy zarazy w terenie są reprezentowane przez jeden lub więcej genotypów) są wszechobecne w krajach, w których uprawa ziemniaków prowadzona jest wyłącznie przez duże gospodarstwa: w USA, Holandii, Danii itd. W Anglii, Irlandii, Polsce, gdzie działki przydomowe są również tradycyjnie rozpowszechnione uprawa ziemniaków, w prywatnych ogrodach występuje również większe zróżnicowanie genotypowe. Pod koniec XX wieku „linie klonalne” były szeroko rozpowszechnione w azjatyckiej i dalekowschodniej części Rosji (Elansky i in., 20), co najwyraźniej wynika z wykorzystania tych samych odmian ziemniaków wyłącznie do sadzenia. W ostatnim czasie sytuacja w tych regionach również zaczęła się zmieniać w kierunku wzrostu różnorodności genotypowej populacji.
Brak intensywnych zabiegów preparatami grzybobójczymi ma jeszcze jedną, bezpośrednią konsekwencję - nie ma kumulacji odpornych szczepów w ogrodach. Rzeczywiście, nasze wyniki pokazują, że szczepy odporne na metalaksyl występują znacznie rzadziej w ogrodach prywatnych niż w nasadzeniach komercyjnych.
Bliskie sąsiedztwo nasadzeń ziemniaków i pomidorów, typowe dla prywatnych ogrodów, sprzyja migracji szczepów pomiędzy tymi uprawami, w wyniku czego w ostatniej dekadzie wśród szczepów izolowanych z ziemniaków udział szczepów niosących gen odporności na odmiany pomidora cherry (T1), wcześniej charakterystyczny tylko dla odmiany pomidorów. Szczepy z genem T1 w większości przypadków są bardzo agresywne zarówno w stosunku do ziemniaków, jak i pomidorów.
W ostatnich latach zaraza późna pomidorów zaczęła pojawiać się w wielu przypadkach wcześniej niż na ziemniakach. Sadzonki pomidorów mogą być zaatakowane przez oospory w glebie lub oospory obecne w nasionach pomidora lub do nich przylegające (Rubin i in., 2001). W ciągu ostatnich 15 lat w sklepach pojawiła się duża liczba niedrogich nasion pakowanych, głównie importowanych, a większość drobnych producentów przestawiła się na ich stosowanie. Nasiona mogą zawierać szczepy o genotypach typowych dla regionów ich uprawy. W przyszłości te genotypy włączane są w proces seksualny w prywatnych ogrodach, co prowadzi do powstania zupełnie nowych genotypów.
Można zatem stwierdzić, że prywatne ogrody warzywne są globalnym „tyglem”, w którym w wyniku wymiany materiału genetycznego przetwarzane są istniejące genotypy i pojawiają się zupełnie nowe. Ponadto ich selekcja odbywa się w warunkach bardzo odmiennych od tych stworzonych dla ziemniaków w dużych gospodarstwach: brak prasy grzybobójczej, wyrównanie odmian nasadzeń, przewaga roślin dotkniętych różnymi formami infekcji wirusowej i bakteryjnej, bliskość pomidorów i dzikich psiankowatych, aktywne krzyżowanie i tworzenie się oospor, możliwość aby oospory działały jako źródło infekcji przez następny rok.
Wszystko to prowadzi do bardzo dużej różnorodności genotypowej populacji przydomowych. W warunkach epifitotycznych zaraza późna rozprzestrzenia się bardzo szybko w ogrodach warzywnych i uwalniane są ogromne ilości zarodników, które latają do pobliskich komercyjnych nasadzeń. Jednak po wejściu na pola komercyjne z odpowiednim systemem techniki rolniczej i ochrony chemicznej, przybyłe zarodniki praktycznie nie mają możliwości zainicjowania epifitotyki na polu, co wynika z braku linii klonalnych odpornych na fungicydy i wyspecjalizowanych w uprawianej odmianie.
Innym źródłem pierwotnego inokulum mogą być chore bulwy uwięzione w komercyjnych sadzonkach. Bulwy te były uprawiane z reguły na polach o dobrej technice rolniczej i intensywnej ochronie chemicznej. Genotypy izolatów infekujących bulwy są dostosowane do rozwoju ich własnej odmiany. Odmiany te są znacznie bardziej niebezpieczne dla sadzenia komercyjnego niż inokulum pochodzące z prywatnych ogrodów. Wyniki naszych badań również potwierdzają to założenie. Populacje izolowane z dużych pól z odpowiednio prowadzoną ochroną chemiczną i dobrą techniką rolniczą nie różnią się dużym zróżnicowaniem genotypowym. Często jest to kilka linii klonalnych, które są bardzo agresywne.
Szczepy z handlowego materiału siewnego mogą przedostawać się do populacji w ogrodach warzywnych i brać udział w zachodzących w nich procesach. Jednak w warzywniaku ich konkurencyjność będzie znacznie niższa niż na polu komercyjnym i wkrótce przestaną istnieć w postaci linii klonalnej, ale ich geny można wykorzystać w populacji „ogrodowej”.
Infekcja, która rozwija się na roślinach „samosiewnych” i na stertach wybrakowanych bulw podczas zbiorów, nie jest tak istotna dla Rosji, ponieważ W głównych regionach uprawy ziemniaków w Rosji obserwuje się głębokie zamarzanie gleby w zimie, a rośliny z bulw, które zimowały w glebie, rzadko się rozwijają. Co więcej, jak pokazują nasze eksperymenty, patogen zarazy nie przeżywa w ujemnych temperaturach nawet na bulwach, które zachowały żywotność. W strefie jałowej, gdzie uprawia się ziemniaki wczesne, zaraza późna występuje dość rzadko ze względu na suchy i gorący sezon wegetacyjny.
Zatem obecnie obserwujemy podział populacji P. infestans na populacje „polne” i „ogrodowe”. Jednak w ostatnich latach obserwuje się procesy prowadzące do konwergencji i przenikania genotypów z tych populacji.
Wśród nich można zauważyć ogólny wzrost umiejętności małych producentów, pojawienie się niedrogich małych opakowań sadzeniaków, rozprzestrzenianie się preparatów grzybobójczych w małych opakowaniach oraz utratę przez ludność strachu przed „chemią”.
Sytuacje powstają, gdy dzięki energicznej działalności jednego dostawcy całe wioski są sadzone bulwami nasiennymi tej samej odmiany i zaopatrywane w małe opakowania tych samych pestycydów. Można przypuszczać, że ziemniaki tej samej odmiany można znaleźć na pobliskich nasadzeniach handlowych.
Z drugiej strony, niektóre firmy zajmujące się handlem pestycydami promują „budżetowe” programy chemicznej obróbki. W tym przypadku liczba zalecanych zabiegów jest niedoszacowana i oferowane są najtańsze fungicydy, a nacisk kładzie się nie na zapobieganie rozwojowi zarazy aż do koszenia wierzchołków, ale na pewne opóźnienie epifitoty w celu zwiększenia plonu. Takie schematy są ekonomicznie uzasadnione przy uprawie ziemniaków jadalnych z materiału siewnego niskiej jakości, kiedy w zasadzie nie ma mowy o uzyskaniu wysokiego plonu. Jednak w tym przypadku, w przeciwieństwie do populacji ogrodniczych, wyrównane podłoże genetyczne ziemniaka przyczynia się do selekcji określonych ras fizjologicznych, które są dla tej odmiany bardzo niebezpieczne.
Generalnie tendencje do konwergencji „ogrodowych” i „polowych” metod produkcji ziemniaków wydają się nam raczej niebezpieczne. Aby zapobiec ich negatywnym konsekwencjom, zarówno w sektorze gospodarczym, jak i handlowym, konieczna będzie kontrola zarówno asortymentu sadzeniaków, jak i asortymentu fungicydów oferowanych prywatnym właścicielom w małych opakowaniach, a także śledzenie programów ochrony ziemniaków i stosowania fungicydów w sektorze handlowym.
Na obszarach sektora prywatnego następuje intensywny rozwój nie tylko zarazy, ale także Alternarii. Większość właścicieli prywatnych działek przydomowych nie podejmuje specjalnych działań w celu ochrony przed Alternarią, biorąc rozwój Alternarii na naturalne więdnięcie liści lub rozwój zarazy. Dlatego wraz z masowym rozwojem Alternarii na odmianach wrażliwych, działki przydomowe mogą służyć jako źródło inokulum do nasadzeń komercyjnych.
Mechanizmy zmienności
Proces mutacji
Ponieważ występowanie mutacji jest procesem losowym przebiegającym z niewielką częstotliwością, występowanie mutacji w dowolnym locus zależy od częstości mutacji tego locus i wielkości populacji. Podczas badania częstości mutacji szczepów P. infestans zwykle określa się liczbę kolonii wyrosłych na selektywnych pożywkach po zastosowaniu mutagenów chemicznych lub fizycznych. Jak widać z danych przedstawionych w Tabeli 8, częstość mutacji tego samego szczepu w różnych loci może różnić się o kilka rzędów wielkości. Wysoka częstotliwość mutacji oporności na metalaksyl może być jedną z przyczyn kumulacji szczepów odpornych na nią w naturze.
Częstość występowania mutacji spontanicznych lub indukowanych, wyliczona na podstawie eksperymentów laboratoryjnych, nie zawsze odpowiada procesom zachodzącym w naturalnych populacjach, z następujących powodów:
1. W przypadku rozszczepień asynchronicznych nie jest możliwe oszacowanie częstotliwości mutacji przypadających na jedno pokolenie jądrowe. Dlatego większość eksperymentów dostarcza informacji tylko bezpośrednio o częstości mutacji, bez rozróżnienia między dwoma zdarzeniami mutacyjnymi i jednym zdarzeniem po mitozie.
2. Mutacje jednoetapowe zwykle obniżają równowagę genomu, dlatego wraz z nabyciem nowej właściwości spada ogólna sprawność organizmu. Większość mutacji uzyskanych eksperymentalnie ma obniżoną agresywność i nie są rejestrowane w naturalnych populacjach. Stąd współczynnik korelacji pomiędzy stopniem odporności mutantów P. infestans na fungicydy fenyloamidowe a tempem wzrostu na sztucznym podłożu wynosił średnio (-0,62), a odpornością na fungicydy i agresywnością liści ziemniaka (-0,65) (Derevyagina et al. , 1993), co wskazuje na niską przydatność mutantów. Mutacjom odporności na dimetomorf towarzyszył również gwałtowny spadek żywotności (Bagirova et al., 2001).
3. Większość spontanicznych i indukowanych mutacji ma charakter recesywny i nie przejawia się fenotypowo w eksperymentach, ale stanowią ukrytą rezerwę zmienności w naturalnych populacjach. Zmutowane szczepy wyizolowane w eksperymentach laboratoryjnych mają mutacje dominujące lub półdominujące (Kulish i Dyakov, 1979). Najwyraźniej diploidalność jądrowa wyjaśnia nieudane próby uzyskania mutantów pod wpływem promieniowania UV, które są zjadliwe dla wcześniej odpornych odmian (McKee, 1969). Według obliczeń autora takie mutacje mogą występować z częstością mniejszą niż 1: 500000 XNUMX. Przejście mutacji recesywnych do stanu homozygotycznego, wyrażanego fenotypowo może nastąpić w wyniku rekombinacji płciowej lub bezpłciowej (patrz poniżej). Jednak nawet w tym przypadku mutacja może być maskowana przez dominujące allele jąder typu dzikiego w cenotycznej (wielojądrowej) grzybni i utrwalana fenotypowo tylko podczas tworzenia jednojądrzastych zoosporów.
Tabela 8. Częstość mutacji P. infestans w substancjach hamujących wzrost pod wpływem nitrozometylomocznika (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova i wsp., 2001)
Połączenie | Częstotliwość mutacji |
Oksytetracyklina | 6,9 10 x-8 |
Blasticidin S. | X 7,2 10-8 |
Streptomycyna | 8,3 х10-8 |
Trichotecyna | 1,8 10 x-8 |
Cykloheksymid | 2,1 10 x-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Dimethomorph | 6,3 10 x-7 |
Metalaksil | 6,9 10 x-6 |
Wielkości populacji również odgrywają decydującą rolę w występowaniu spontanicznych mutacji. W bardzo dużych populacjach, w których liczba komórek N> 1 / a, gdzie a jest wskaźnikiem mutacji, przestaje być zjawiskiem losowym (Kvitko, 1974).
Obliczenia pokazują, że przy średnim porażeniu pola ziemniaka (35 plam na roślinę) dziennie na jednym hektarze tworzy się 8x1012 zarodników (Dyakov i Suprun, 1984). Najwyraźniej takie populacje zawierają wszystkie mutacje dozwolone przez typ wymiany w każdym locus. Nawet rzadką mutację, występującą z częstotliwością 10-9, przejmie tysiąc osobników z milionów żyjących na jednym hektarze pola ziemniaków. W przypadku mutacji występujących z większą częstością (na przykład 10-6), w takiej populacji mogą występować różne sparowane mutacje codziennie (jednocześnie w dwóch loci), tj. proces mutacji zastąpi rekombinację.
Migracje
W przypadku P. infestans znane są dwa główne typy migracji: na małe odległości (w obrębie pola ziemniaczanego lub na sąsiednich polach) poprzez rozprzestrzenianie zoosporangii przez prądy powietrza lub opryski oraz na duże odległości - podczas sadzenia bulw lub transportowanych owoców pomidora. Pierwsza metoda zapewnia rozszerzenie ogniska choroby, druga - tworzenie nowych ognisk w miejscach oddalonych od pierwotnego.
Rozprzestrzenianie się infekcji bulwami i owocami pomidora nie tylko przyczynia się do pojawienia się choroby w nowych miejscach, ale jest także głównym źródłem różnorodności genetycznej populacji. W regionie moskiewskim uprawia się ziemniaki sprowadzane z różnych regionów Rosji i Europy Zachodniej. Owoce pomidora sprowadzane są z południowych regionów Rosji (region Astrachania, region Krasnodar, Północny Kaukaz). Nasiona pomidora, które mogą również służyć jako źródło infekcji (Rubin i in., 2001), są również importowane z południowych regionów Rosji, Chin, krajów europejskich i innych krajów.
Według obliczeń E. Mayra (1974) zmiany genetyczne w lokalnej populacji spowodowane mutacjami rzadko przekraczają 10-5 na locus, podczas gdy w populacjach otwartych wymiana z powodu przeciwprądu genów wynosi co najmniej 10-3 - 10-4.
Migracja zarażonych bulw jest odpowiedzialna za przedostanie się P. infestans do Europy, rozprzestrzeniając się na wszystkie regiony świata, w których uprawiane są ziemniaki; spowodowali najpoważniejsze zmiany w populacji. Zaraza późna ziemniaków pojawiła się na terytorium Imperium Rosyjskiego niemal jednocześnie z jej pojawieniem się w Europie Zachodniej.
Ponieważ choroba została po raz pierwszy zauważona w latach 1846-1847 w krajach bałtyckich, a dopiero w kolejnych latach rozprzestrzeniła się na Białorusi i północno-zachodnich regionach Rosji, jej zachodnioeuropejskie pochodzenie jest oczywiste. Pierwsze źródło zarazy w Starym Świecie nie jest takie oczywiste. Hipoteza sformułowana przez Fry i wsp. (Fry i wsp., 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin i wsp., 1994) sugeruje, że pasożyt najpierw przybył z Meksyku do Ameryki Północnej, gdzie rozprzestrzenił się przez uprawy, a następnie został przetransportowany do Europy Zachodniej. (rys. 7).
W wyniku powtarzającego się dryfu (podwójny efekt „wąskiego gardła”) do Europy dotarły pojedyncze klony, których potomstwo wywołało pandemię na całym terytorium Starego Świata, gdzie uprawia się ziemniaki. Na dowód tej hipotezy autorzy przytaczają, po pierwsze, wszechobecność tylko jednego typu kojarzenia (A1), a po drugie jednorodność genotypów badanych szczepów z różnych regionów (wszystkie za pomocą markerów molekularnych, w tym 2 loci izozymów, wzorców odcisku palca DNA i struktura mitochondrialnego DNA jest identyczna i odpowiada klonowi US-1 opisanemu w USA). Jednak niektóre dane budzą wątpliwości co do przynajmniej części zapisów postawionej hipotezy. Analiza mitochondrialnego DNA P. infestans wyizolowanego z próbek zielnikowych ziemniaków zakażonych w pierwszym okresie epifitotycznym w latach czterdziestych XIX wieku wykazała, że różnią się one budową mitochondrialnego DNA klonu US-40, który w związku z tym był co najmniej nie jedyne źródło infekcji w Europie (Ristaino i in., 1).
Sytuacja zarazy późnej ponownie się pogorszyła w latach 80. XX wieku. Nastąpiły następujące zmiany:
1) Wzrosła średnia agresywność populacji, co doprowadziło w szczególności do powszechnego rozprzestrzeniania się najbardziej szkodliwej formy zarazy - uszkodzenia ogonków i łodyg.
2) Nastąpiło przesunięcie pory zarazy ziemniaków - od końca lipca do początku lipca, a nawet do końca czerwca.
3) Typ krycia A2, którego wcześniej nie było w Starym Świecie, stał się wszechobecny.
Zmiany poprzedziły dwa wydarzenia: masowe stosowanie nowego metalaksylu fungicydu (Schwinn i Staub, 1980) oraz pojawienie się Meksyku jako światowego eksportera ziemniaków (Niederhauser, 1993). W związku z tym wysunięto dwie przyczyny zmian populacyjnych: konwersję typu kojarzenia pod wpływem metalaksylu (Ko, 1994) oraz masowe wprowadzenie nowych odmian z zakażonymi bulwami z Meksyku (Fry i Goodwin, 1995). Chociaż interkonwersje typów godowych pod wpływem metalaksylu zostały uzyskane nie tylko przez Ko, ale także w pracach wykonanych w laboratorium Uniwersytetu Moskiewskiego (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), preferowana jest hipoteza druga. Wraz z pojawieniem się drugiego typu kojarzenia zaszły poważne zmiany w genotypach rosyjskich szczepów P. infestans, w tym w genach obojętnych (loci izozymów i RFLP), a także w strukturze mitochondrialnego DNA. Złożoności tych zmian nie można wyjaśnić działaniem metalaksylu; raczej nastąpił masowy import nowych szczepów z Meksyku, które będąc bardziej agresywnymi (Kato i wsp., 1997) wyparły stare szczepy (US-1), stając się dominującymi w populacjach. Zmiana składu populacji europejskich nastąpiła w bardzo krótkim czasie - od 1980 do 1985 (Fry i in., 1992). Na terenie byłego ZSRR „nowe szczepy” znaleziono w zbiorach z Estonii w 1985 roku, a więc wcześniej niż w Polsce i Niemczech (Goodwin i in., 1994). Ostatni raz „stary szczep US-1” w Rosji został wyizolowany z zainfekowanego pomidora w rejonie Moskwy w 1993 r. (Dolgova et al., 1997). Również we Francji „stare” odmiany znajdowano w sadzonkach pomidorów aż do wczesnych lat 90., czyli po tym, jak dawno zniknęły na ziemniakach (Leberton i Andrivon, 1998). Zmiany w szczepach P. infestans wpłynęły na wiele cech, w tym o dużym znaczeniu praktycznym, i zwiększyły szkodliwość zarazy.
Rekombinacja płciowa
Aby rekombinacja płciowa przyczyniła się do zmienności, konieczna jest po pierwsze obecność w populacji dwóch typów kojarzenia w stosunku bliskim 1: 1, a po drugie obecność początkowej zmienności populacji.
Stosunek typów krycia różni się znacznie w różnych populacjach, a nawet w różnych latach w jednej populacji (Tabela 9,10, 90). Przyczyny tak drastycznych zmian w częstości kojarzeń w populacjach (jak np. W Rosji czy w Izraelu na początku lat 2002. ubiegłego wieku) są nieznane, ale uważa się, że jest to spowodowane wprowadzeniem bardziej konkurencyjnych klonów (Cohen, XNUMX).
Niektóre dane pośrednie wskazują na przebieg procesu seksualnego w określonych latach i w niektórych regionach:
1) Badania populacji z regionu moskiewskiego wykazały, że w 13 populacjach, w których udział typu krycia A2 był mniejszy niż 10%, łączne zróżnicowanie genetyczne obliczone dla trzech loci izozymów wyniosło 0,08, aw 14 populacjach, w których udział A2 był 30% różnorodność genetyczna była dwukrotnie wyższa (0,15) (Elansky i in., 1999). Zatem im większe prawdopodobieństwo stosunku płciowego, tym większa różnorodność genetyczna populacji.
2) Zależność między stosunkiem typów kojarzeń w populacjach a intensywnością tworzenia się oospor zaobserwowano w Izraelu (Cohen i in., 1997) oraz w Holandii
(Flier i in., 2004). Nasze badania wykazały, że w populacjach, w których izolaty z typem krycia A2 stanowiły 62, 17, 9 i 6%, oospory stwierdzono odpowiednio w 78, 50, 30 i 15% analizowanych liści ziemniaka (z 2 lub więcej plamkami).
Próbki z 2 lub więcej plamkami istotnie częściej zawierały oospory niż próbki z 1 plamką (odpowiednio 32 i 14% próbek) (Apryshko i in., 2004).
Oospory występowały znacznie częściej w liściach środkowej i dolnej warstwy ziemniaka (Mytsa i in., 2015; Elansky i in., 2016).
3) W niektórych regionach odkryto unikalne genotypy, których występowanie wiąże się z rekombinacją płciową. Tak więc w Polsce w 1989 r. I we Francji w 1990 r. Szczepy homozygotyczne pod względem glukozy-6
izomeraza fosforanowa (GPI 90/90). Ponieważ wcześniej przez 10 lat spotykano tylko 90/100 heterozygot, homozygotyczność przypisuje się rekombinacji płciowej (Sujkowski i wsp., 1994). W Kolumbii (USA) pospolite są izolaty łączące A2 z GPI 100/110 oraz A1 z GPI 100/100, jednak pod koniec sezonu 1994 (16 sierpnia i 9 września) szczepy o rekombinowanych genotypach (A1 GPI 100/110 i A2 GPI 100/100) (Miller i wsp., 1997).
4) W niektórych populacjach z Polski (Sujkowski i in., 1994) oraz z Północnego Kaukazu (Amatkhanova i in., 2004) rozkład loci DNA odcisków palców i loci białek allozymów odpowiada rozkładowi Hardy-Weinberga, co wskazuje na
o wysokim udziale rekombinacji płciowej w zmienności populacji. W innych regionach Rosji nie stwierdzono zgodności z rozkładem Hardy'ego-Weinberga w populacjach, ale wykazano obecność nierównowagi sprzężeń, wskazującą na przewagę rozmnażania klonalnego (Elansky i in., 1999).
5) Zróżnicowanie genetyczne (GST) między szczepami o różnych typach kojarzenia (A1 i A2) było mniejsze niż między różnymi populacjami (Sujkowski i in., 1994), co pośrednio wskazuje na krzyżówki płciowe.
Jednocześnie wkład rekombinacji płciowej w różnorodność populacji nie może być bardzo duży. Udział ten został obliczony dla populacji regionu moskiewskiego (Elansky i in., 1999). Według obliczeń Lewontina (1979) „rekombinacja, która może wytworzyć nowe warianty z dwóch loci z częstotliwością nieprzekraczającą iloczynu ich heterozygotyczności, staje się skuteczna tylko wtedy, gdy wartości heterozygotyczności obu alleli są już wysokie”.
Przy stosunku dwóch typów parowania, który jest typowy dla regionu moskiewskiego, równym 4: 1, częstotliwość rekombinacji wyniesie 0,25. Prawdopodobieństwo, że krzyżowane szczepy będą heterozygotyczne dla dwóch z trzech badanych loci izozymów w badanych populacjach, wyniosło 0,01 (2 szczepy ze 177). Dlatego prawdopodobieństwo wystąpienia podwójnych heterozygot w wyniku rekombinacji nie powinno przekraczać ich iloczynu pomnożonego przez prawdopodobieństwo krzyżowania (0,25x0,02x0,02) = 10-4, tj. rekombinanty płciowe zwykle nie należą do badanej próbki szczepów. Obliczenia te wykonano dla populacji z regionu moskiewskiego charakteryzujących się stosunkowo dużą zmiennością. W populacjach monomorficznych, takich jak syberyjskie, proces płciowy, nawet jeśli zachodzi w populacjach indywidualnych, nie może wpływać na ich różnorodność genetyczną.
Ponadto P. infestans charakteryzuje się częstym nieprawidłowym ułożeniem chromosomów w mejozie, co prowadzi do aneuploidii (Carter i wsp., 1999). Takie naruszenia zmniejszają płodność hybryd.
Rekombinacja paraseksualna, mitotyczna konwersja genów
W doświadczeniach dotyczących fuzji szczepów P. infestans z mutacjami oporności na różne inhibitory wzrostu, stwierdzono pojawienie się mizolanów opornych na oba inhibitory (Shattock i Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Szczepy oporne na dwa inhibitory wzrostu powstały w wyniku heterokariotyzacji grzybni iw tym przypadku rozszczepiały się podczas rozmnażania przez mononuklearne zoospory (Judelson, Ge Yang, 1998) lub nie rozszczepiały się u potomstwa monozoosporowatego, gdyż posiadały jądra tetraploidalne (gdyż początkowe izolaty są diploidalne) (K , 1979). Diploidy heterozygotyczne segregowały się z bardzo niską częstotliwością z powodu haploidyzacji, braku dysjunkcji chromosomów i krzyżowania mitotycznego (Poedinok et al., 1982). Częstotliwość tych procesów można zwiększyć za pomocą pewnych efektów na heterozygotyczne dyploidy (na przykład promieniowanie UV kiełkujących zarodników).
Chociaż tworzenie hybryd wegetatywnych o podwójnej oporności zachodzi nie tylko in vitro, ale także w bulwach ziemniaka zakażonych mieszanką mutantów (Kulish i in., 1978), raczej trudno jest ocenić rolę rekombinacji paraseksualnej w tworzeniu nowych genotypów w populacjach. Częstotliwość tworzenia się segregantów z powodu haploidyzacji, nierozłączności chromosomów i przejścia mitotycznego bez efektów specjalnych jest znikoma (poniżej 10-3).
Pojawienie się homozygotycznych segregantów szczepów heterozygotycznych może być oparte zarówno na krzyżowaniu mitotycznym, jak i mitotycznej konwersji genów, która u P. sojae występuje z częstością od 3 x 10-2 do 5 x 10-5 na locus, w zależności od szczepu (Chamnanpunt et al. 2001).
Choć częstość występowania heterokarionów i heterozygotycznych dyploidów okazała się nieoczekiwanie wysoka (sięgająca kilkudziesięciu procent), to proces ten zachodzi tylko w przypadku składania zmutowanych kultur pochodzących z tego samego szczepu. W przypadku stosowania różnych szczepów izolowanych z natury heterokariotyzacja nie występuje (lub występuje z bardzo niską częstotliwością) z powodu obecności niezgodności wegetatywnej (Poedinok i Dyakov, 1981; Anikina i wsp., 1997b; Cherepennikova-Anikina i wsp., 2002). W konsekwencji rola rekombinacji paraseksualnej może być ograniczona tylko do rekombinacji wewnątrzaklonalnej w jądrach heterozygotycznych i przejścia poszczególnych genów do stanu homozygotycznego bez procesu seksualnego. Proces ten może mieć znaczenie epidemiologiczne w szczepach z recesywnymi lub półdominującymi mutacjami oporności na fungicydy. Jego przejście do stanu homozygotycznego w wyniku procesu paraseksualnego zwiększy odporność nosiciela mutacji (Dolgova, Dyakov, 1986).
Introgresja genów
Gatunki heterotaliczne Phytophthora są zdolne do krzyżowania się z tworzeniem hybrydowych oospor (patrz Vorob'eva i Gridnev, 1983; Sansome i wsp., 1991; Veld i wsp., 1998). Naturalna hybryda dwóch gatunków Phytophthora była tak agresywna, że zabiła tysiące olszy w Wielkiej Brytanii (Brasier et al., 1999). P. infestans może występować z innymi gatunkami z rodzaju (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum itp.) Na pospolitych roślinach żywicielskich iw glebie, ale w literaturze jest niewiele informacji na temat możliwości mieszańców międzygatunkowych. W warunkach laboratoryjnych uzyskano mieszańce między P. infestans i P. Mirabilis (Goodwin i Fry, 1994).
Tabela 9. Odsetek szczepów P. infestans z typem krycia A2 w różnych krajach świata w latach 1990-2000 (według danych z otwartych źródeł literaturowych i witryn www.euroblight.net, www.eucablight.org)
kraj | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Białoruś | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Belgia | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ekwador | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Estonia | 8 (12) | ||||||||||
Anglia | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Finlandia | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Francja | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Węgry | 72 (32) | ||||||||||
Irlandia | 4 (145) | ||||||||||
Północ. Irlandia | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Niderlandy | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Norwegia | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Peru | 0 (34, 1984-86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Polska | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Szkocja | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Szwecja | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Walia | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Korea | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
Chiny | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Kolumbia | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Urugwaj | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Maroko | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
Meksyk (Toluca) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Tabela 10. Odsetek szczepów P. infestans z typem krycia A2 w różnych krajach świata w latach 2000-2011
kraj | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Austria | 65 (83) | ||||||||||
Białoruś | 42 (78) | ||||||||||
Belgia | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Szwajcaria | 89 (19) | ||||||||||
Czechy | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Niemcy | 95 (53) | ||||||||||
Dania | 48 (52) | ||||||||||
Ekwador | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Estonia | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Anglia | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Finlandia | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Francja | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Węgry | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Północ. Irlandia | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Niderlandy | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Norwegia | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Peru | 0 (36) | ||||||||||
Polska | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Szkocja | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Szwecja | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Słowacja | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Walia | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Korea | 46 (26) | ||||||||||
Brazylia | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
Chiny | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Wietnam | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Dynamika składu genotypowego populacji
Zmiany w składzie genotypowym populacji P. infestans mogą zachodzić pod wpływem migracji nowych klonów z innych regionów, praktyk rolniczych (zmiana odmian, stosowanie fungicydów) oraz warunków pogodowych. Wpływy zewnętrzne w różny sposób wpływają na klony na różnych etapach cyklu życiowego, dlatego populacje corocznie doświadczają cyklicznych zmian częstości genów podlegających selekcji, ze względu na zmianę dominującej roli dryfu genów i selekcji.
Wpływ odmiany
Nowe odmiany z efektywnymi genami odporności pionowej (geny R) są silnym selektywnym czynnikiem, który wybiera klony z komplementarnymi genami wirulencji w populacjach P. infestans. W przypadku braku niespecyficznej odporności odmiany ziemniaka, która hamuje wzrost populacji patogenu, proces zastępowania dominujących klonów w populacji zachodzi bardzo szybko. Tak więc po rozprzestrzenieniu się w regionie moskiewskim odmiany Domodedovsky, która ma gen odporności R3, częstość występowania klonów zjadliwych dla tej odmiany wzrosła z 0,2 do 0,82 w ciągu jednego roku (Dyakov, Derevjagina, 2000).
Jednak zmiana częstości występowania genów wirulencji (patotypów) w populacjach następuje nie tylko pod wpływem uprawnych odmian ziemniaka. Na przykład na Białorusi do 1977 r. Dominowały klony z genami wirulencji 1 i 4, co było spowodowane uprawą odmian ziemniaka z genami odporności R1 i R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). Jednak pod koniec lat 70-tych XX wieku pojawiły się klony z różnymi genami wirulencji i ich kombinacjami, a komplementarne geny odporności nigdy nie były używane w hodowli ziemniaków (geny ekstra zjadliwości) (Ivanyuk et al., 2002). Najwyraźniej przyczyną pojawienia się takich klonów jest migracja do Europy materiału zakaźnego z Meksyku wraz z bulwami ziemniaka. W domu klony te rozwinęły się nie tylko na uprawianych ziemniakach, ale także na dzikich gatunkach niosących różnorodne geny odporności, dlatego połączenie wielu genów wirulencji w genomie było niezbędne do przetrwania w tych warunkach.
Jeśli chodzi o odmiany o niespecyficznej odporności, to one, zmniejszając tempo rozmnażania się patogenu, opóźniają ewolucję jego populacji, co, jak już wspomniano, jest funkcją liczby. Ponieważ agresywność jest poligeniczna, klony zawierające większą liczbę genów „agresywności” akumulują się im szybciej, im większa jest wielkość populacji. Dlatego rasy wysoce agresywne nie są produktem adaptacji do odmian uprawnych o niespecyficznej odporności, a wręcz przeciwnie, są bardziej prawdopodobne w nasadzeniach odmian wysoce wrażliwych, które są akumulatorami zarodników pasożytów.
Tak więc w Rosji najbardziej agresywne populacje P. Infestans stwierdzono w strefach epifitotii rocznych (populacje z regionów Sachalina, Leningradu i Briańska). Agresywność tych populacji okazała się wyższa niż populacji meksykańskiej (Filippov i in., 2004).
Ponadto w liściach odmian odpornych powstaje mniej oospor niż u odmian wrażliwych (Hanson i Shattock, 1998), to znaczy niespecyficzna odporność odmiany zmniejsza również zdolność pasożyta do rekombinacji i możliwość alternatywnych metod zimowania.
Wpływ fungicydów
Fungicydy nie tylko zmniejszają liczbę fitopatogennych grzybów, tj. wpływają na ilościowe cechy swoich populacji, ale mogą też zmieniać częstości występowania poszczególnych genotypów, tj. wpływać na skład jakościowy populacji. Do najważniejszych wskaźników zmian populacji pod wpływem fungicydów należą: zmiany odporności na fungicydy, zmiany agresywności i zjadliwości oraz zmiany w systemach hodowlanych.
Wpływ fungicydów na odporność i agresywność populacji
Stopień tego wpływu zależy przede wszystkim od rodzaju zastosowanego fungicydu, który można warunkowo podzielić na polisyt, oligozyt i monozyt.
Pierwsza z nich obejmuje większość fungicydów kontaktowych. Odporność na nie (o ile to w ogóle możliwe) jest kontrolowana przez dużą liczbę genów o bardzo słabej ekspresji. Właściwości te determinują brak widocznych zmian w odporności populacji po działaniu fungicydami (chociaż w niektórych eksperymentach uzyskano pewien wzrost odporności). Populacja grzybów zachowana po opryskach fungicydami kontaktowymi składa się z dwóch grup szczepów:
1) Szczepy zachowane na obszarach roślin nie poddanych działaniu leku. Ponieważ nie było kontaktu z fungicydem, agresywność i odporność tych szczepów nie zmienia się.
2) Szczepy stykające się z fungicydem, których stężenie w punktach kontaktu było niższe niż śmiertelne. Jak wspomniano powyżej, odporność tej części populacji również się nie zmienia, jednak ze względu na częściowe niszczące działanie fungicydu nawet w subletalnym stężeniu na metabolizm komórki grzyba, ogólną sprawność i jej pasożytniczy składnik, agresywność, spadek (Derevyagina i Dyakov, 1990).
Dlatego nawet część populacji, która nie zmarła, narażona na kontakt z fungicydem, ma słabą agresywność i nie może być źródłem epifitotyków. Dlatego warunkiem powodzenia działań ochronnych jest staranne przetwarzanie, które zmniejsza częstotliwość populacji, która nie ma kontaktu z fungicydem. Odporność na fungicydy oligozytowe jest kontrolowana przez kilka genów addytywnych.
Mutacja każdego genu prowadzi do pewnego wzrostu oporności, a ogólny stopień oporności wynika z dodania takich mutacji. Dlatego wzrost oporu następuje stopniowo. Przykładem stopniowego wzrostu odporności są mutacje oporności na fungicyd dimetomorf, który jest szeroko stosowany do ochrony ziemniaków przed zarazą. Odporność na dimetomorfy jest wielogenowa i addytywna. Mutacja jednoetapowa nieznacznie zwiększa odporność.
Każda kolejna mutacja zmniejsza docelowy rozmiar, a tym samym częstotliwość kolejnych mutacji (Bagirova i wsp., 2001). Wzrost średniej odporności populacji po wielokrotnych zabiegach fungicydem oligozytowym następuje stopniowo i stopniowo. O szybkości tego procesu decydują co najmniej trzy czynniki: częstość mutacji genów oporności, współczynnik oporności (stosunek dawki śmiertelnej szczepu opornego do wrażliwego) oraz wpływ mutacji genów oporności na przystosowanie.
Częstość występowania każdej kolejnej mutacji jest niższa niż poprzedniej, więc proces ma charakter tłumiący (Bagirova i in., 2001). Jeśli jednak w populacji zachodzą procesy rekombinacyjne (seksualne lub paraseksualne), to można połączyć różne mutacje rodziców w szczepie hybrydowym i przyspieszyć ten proces. Dlatego populacje panmix uzyskują odporność szybciej niż populacje agamiczne, aw tych ostatnich populacje, które nie mają wegetatywnych barier niezgodności szybciej niż populacje podzielone takimi barierami. Pod tym względem obecność szczepów w populacjach różniących się typami krycia przyspiesza proces uzyskiwania odporności na fungicydy oligozytowe.
Drugi i trzeci czynnik nie przyczyniają się do szybkiego gromadzenia szczepów opornych na dimetomorfy w populacjach. Każda kolejna mutacja w przybliżeniu podwaja oporność, która jest nieistotna, a jednocześnie zmniejsza zarówno tempo wzrostu w sztucznym środowisku, jak i agresywność (Bagirova i in., 2001; Stem, Kirk, 2004). Być może dlatego wśród naturalnych szczepów P. infestans praktycznie nie ma szczepów odpornych, nawet tych zebranych z sadzonek ziemniaków traktowanych dimetomorfem.
Populacja traktowana fungicydem oligozytowym będzie również składać się z dwóch grup szczepów: tych, które nie miały kontaktu z fungicydem, a zatem nie zmieniły początkowych cech (jeśli w tej grupie znajdują się szczepy oporne, nie będą się kumulować ze względu na wyższą agresywność i konkurencyjność szczepów wrażliwych), i szczepy w kontakcie ze subletalnymi stężeniami fungicydu. To właśnie do tych ostatnich możliwa jest kumulacja szczepów opornych, ponieważ tutaj mają one przewagę nad wrażliwymi.
Dlatego przy stosowaniu fungicydów oligozytowych ważna jest nie tyle dokładna kuracja, co wysokie stężenie leku, kilkakrotnie wyższe od dawki śmiertelnej, gdyż przy mutagenezie stopniowej początkowa oporność zmutowanych szczepów jest niska.
Wreszcie mutacje w oporności na fungicydy monozydowe są wysoce ekspresyjne, to znaczy pojedyncza mutacja może wykazywać wysoki poziom odporności, aż do całkowitej utraty wrażliwości. Dlatego wzrost odporności populacji następuje bardzo szybko.
Przykładem takich fungicydów są fenyloamidy, w tym najpopularniejszy fungicyd metalaksyl. Mutacje odporności na nią występują z dużą częstotliwością, a stopień odporności mutantów jest bardzo wysoki - przekracza tysiąckrotnie lub więcej wrażliwy szczep (Derevyagina i in., 1993). Chociaż tempo wzrostu i agresywność opornych mutantów spada na tle śmierci wrażliwych szczepów z ogólnoustrojowego fungicydu, liczba opornych populacji szybko rośnie, a jej agresywność rośnie równolegle. Dlatego po kilku latach stosowania fungicydu agresywność szczepów odpornych może nie tylko dorównać agresywności wrażliwych, ale także ją przewyższyć (Derevyagina, Dyakov, 1992).
Wpływ na rekombinację płciową
Ponieważ częste występowanie krycia typu A2 w populacjach P. infestans zbiegło się z intensywnym stosowaniem metalaksylu przeciwko zarazie późnej, przyjęto, że metalaksyl wywołuje konwersję typu kojarzenia. U P. parasitica taką przemianę pod wpływem Chloronebu i metalaksylu udowodniono eksperymentalnie (Ko, 1994). Pojedyncze przejście na podłożu o niskim stężeniu metalaksylu doprowadziło do powstania homotalicznych izolatów szczepu P. infestans wrażliwego na metalaksyl z kojarzeniem typu A1 (Savenkova i Cherepnikova-Anikina, 2002). Podczas kolejnych pasaży na pożywkach o wyższym stężeniu metalaksylu nie wykryto ani jednego izolatu typu parowania A2, jednak większość izolatów po skrzyżowaniu z izolatami A2 zamiast oosporów tworzyła brzydkie nagromadzenia grzybni i była sterylna. Pasaże szczepu opornego mającego typ krycia A2 na pożywkach z wysokim stężeniem metalaksylu pozwoliły na wykrycie trzech form zmian typu krycia: 1) całkowita bezpłodność przy skrzyżowaniu z izolatami A1 i A2; 2) homotalizm (tworzenie się oospor w monokulturze); 3) konwersja typu krycia A2 na A1. Zatem metalaksyl może powodować zmiany w typach kojarzenia w populacjach P. infestans, aw konsekwencji rekombinację płciową w nich.
Wpływ na rekombinację wegetatywną
Niektóre geny oporności na antybiotyki zwiększały częstotliwość heterokariotyzacji strzępków i diploidyzacji jądrowej (Poedinok i Dyakov, 1981). Jak wspomniano wcześniej, heterokariotyzacja strzępek podczas fuzji różnych szczepów P. infestans występuje bardzo rzadko ze względu na zjawisko niezgodności wegetatywnej u tego grzyba. Jednak geny oporności na niektóre antybiotyki mogą mieć skutki uboczne, wyrażane w przezwyciężaniu niezgodności wegetatywnej. Właściwość tę posiadał zmutowany gen oporności na streptomycynę 1S-1. Obecność takich mutantów w populacjach terenowych phytophthora może zwiększyć przepływ genów między szczepami i przyspieszyć adaptację całej populacji do nowych odmian lub fungicydów.
Niektóre fungicydy i antybiotyki mogą wpływać na częstotliwość rekombinacji mitotycznej, która może również zmieniać częstość występowania genotypów w populacjach. Powszechnie stosowany fungicyd benomyl wiąże się z beta-tubuliną, białkiem, z którego zbudowane są mikrotubule cytoszkieletu, a tym samym zaburza procesy separacji chromosomów w anafazie mitozy, zwiększając częstotliwość rekombinacji mitotycznej (Hastie, 1970).
Fungicyd para-fluorofenyloalanina, stosowany w leczeniu holenderskiej choroby wiązów, ma te same właściwości. Para-fluorofenyloalanina zwiększyła częstość rekombinacji u heterozygotycznych dyploidów P. infestans (Poedinok i wsp., 1982).
Cykliczne zmiany w składzie genotypowym populacji w cyklu życiowym P. infestans
Klasyczny cykl rozwojowy P. infestans w strefie umiarkowanej składa się z 4 faz.
1) Faza wykładniczego wzrostu populacji (faza policykliczna) o krótkich pokoleniach. Faza ta zwykle rozpoczyna się w lipcu i trwa 1,5-2 miesiące.
2) Faza zatrzymania wzrostu populacji na skutek gwałtownego spadku udziału tkanki nienaruszonej lub wystąpienia niekorzystnych warunków atmosferycznych. Ta faza w gospodarstwach przeprowadzających wczesne usuwanie liści przed zbiorami wychodzi poza cykl roczny.
3) Faza zimowania bulw, której towarzyszy znaczący spadek liczebności populacji w wyniku przypadkowego zakażenia bulw, powolny rozwój infekcji, brak ponownego zakażenia bulw, gnicie i ubój porażonych bulw w normalnych warunkach przechowywania.
4) Faza powolnego rozwoju w glebie i na sadzonkach (faza monocykliczna), w której pokolenie może trwać miesiąc lub dłużej (koniec maja - początek lipca). Zwykle w tej chwili chore liście są trudne do wykrycia nawet przy specjalnych obserwacjach.
Faza wykładniczego wzrostu populacji (faza policykliczna)
Liczne obserwacje (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) wykazały, że na początku epifitoty przeważają klony nisko zjadliwe i nieco agresywne, które są następnie zastępowane przez bardziej zjadliwe i agresywne. tempo wzrostu agresywności populacji jest tym większe, im mniej odporna jest odmiana rośliny żywicielskiej.
Wraz ze wzrostem populacji wzrasta koncentracja zarówno wybiórczo ważnych genów wprowadzanych do odmian handlowych (R1-R4), jak i wybiórczo neutralnych (R5-R11). Tak więc w populacjach pod Moskwą w 1993 roku średnia zjadliwość od końca lipca do połowy sierpnia wzrosła z 8,2 do 9,4, a największy wzrost zaobserwowano dla wybiórczo neutralnego genu wirulencji R5 (z 31 do 86% zjadliwych klonów) (Smirnov, 1996 ).
Spadkowi tempa wzrostu populacji towarzyszy spadek aktywności pasożytniczej populacji. Dlatego w latach depresyjnych zarówno całkowita liczba ras, jak i odsetek ras wysoce zjadliwych są niższe niż w epifitotycznych (Borisenok, 1969). Jeśli w szczytowym okresie epifitotycznych warunków pogodowych zmieniają się niekorzystne dla zarazy i plagi ziemniaka spada, zmniejsza się również koncentracja klonów silnie zjadliwych i agresywnych (Rybakova i in., 1987).
Wzrost częstotliwości genów wpływających na zjadliwość i agresywność populacji może wynikać z selekcji bardziej zjadliwych i agresywnych klonów w populacji mieszanej. Aby zademonstrować selekcję, opracowano metodę analizy mutacji obojętnych, którą z powodzeniem zastosowano w populacjach chemostatów drożdży (Adams i in., 1985) oraz Fusarium graminearum (Wiebe i in., 1995).
Częstość występowania mutantów opornych na blastycydynę S w populacji terenowej P. infestans malała równolegle ze wzrostem agresywności populacji, co wskazuje na zmianę dominujących klonów w trakcie wzrostu populacji (Rybakova i in., 1987).
Faza zimowania bulw
Podczas zimowania bulw ziemniaka zjadliwość i agresywność szczepów P. infestans spada, a spadek zjadliwości zachodzi wolniej niż agresywność (Rybakova i Dyakov, 1990). Najwyraźniej w warunkach sprzyjających szybkiemu wzrostowi populacji (selekcja r) przydatne są geny „extra” zjadliwości i wysoka agresywność, dlatego też rozwojowi epifitotyków towarzyszy selekcja najbardziej zjadliwych i agresywnych klonów. W warunkach nasycenia środowiska, gdy nie tempo rozmnażania się, ale utrzymywanie się istnienia w niekorzystnych warunkach (selekcja K) odgrywa ważną rolę, „dodatkowe” geny zjadliwości i agresywności zmniejszają przystosowanie, a klony z tymi genami wymierają jako pierwsze, tak że przeciętna agresywność i zjadliwość populacji spada.
Faza wegetacji w glebie
Ta faza jest najbardziej tajemnicza w cyklu życia (Andrivon, 1995). Jej istnienie postuluje się czysto spekulacyjnie - ze względu na brak informacji o tym, co dzieje się z patogenem w długim okresie (niekiedy ponad miesiąc) - od pojawienia się sadzonek ziemniaka do pojawienia się na nich pierwszych plam choroby. Na podstawie obserwacji i eksperymentów odtworzono zachowanie grzyba w tym okresie życia (Hirst i Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
Zarodnikowanie grzyba może tworzyć się na porażonych bulwach w glebie. Powstałe zarodniki kiełkują ze strzępkami, które mogą wegetować przez długi czas w glebie. Zarodniki pierwotne (powstałe na bulwach) i wtórne (na grzybni w glebie) unoszą się na powierzchnię gleby przez prądy kapilarne, ale zdolność infekowania ziemniaków uzyskują dopiero po opadnięciu dolnych liści i zetknięciu z powierzchnią gleby. Takie liście (a mianowicie pierwsze plamy choroby) nie tworzą się natychmiast, ale po dłuższym wzroście i rozwoju wierzchołków ziemniaków.
Zatem faza wegetacji saprotroficznej może również występować w cyklu życiowym P. infestans. Jeśli w pasożytniczej fazie cyklu życiowego agresywność jest najważniejszym składnikiem sprawności, to w fazie saprotroficznej selekcja ma na celu zmniejszenie właściwości pasożytniczych, jak wykazano doświadczalnie dla niektórych fitopatogennych grzybów (patrz Carson, 1993). Dlatego w tej fazie cyklu agresywne właściwości powinny być tracone najbardziej intensywnie. Jednak jak dotąd nie przeprowadzono żadnych bezpośrednich eksperymentów potwierdzających powyższe założenia.
Zmiany sezonowe wpływają nie tylko na patogenne właściwości P. infestans, ale także na odporność na fungicydy, która rośnie w fazie policyklicznej (podczas epifitotii) i zmniejsza się podczas zimowania (Derevyagina i in., 1991; Kadish i Cohen, 1992). Szczególnie intensywny spadek odporności na metalaksyl zaobserwowano pomiędzy zasadzeniem porażonych bulw a pojawieniem się pierwszych plam choroby na polu.
Specjalizacja wewnątrzgatunkowa i jej ewolucja
P. infestans powoduje epidemie w dwóch uprawach roślin ważnych pod względem handlowym, ziemniakach i pomidorach. Epifitotia ziemniaków rozpoczęła się wkrótce po tym, jak grzyb wszedł na nowe obszary. Klęskę pomidora odnotowano również wkrótce po pojawieniu się infekcji na ziemniakach, ale epifitotię pomidora odnotowano dopiero sto lat później - w połowie XX wieku. Oto, co Hallegli i Niederhauser piszą o klęsce pomidorów w USA
(1962): „Przez około 100 lat po ciężkiej epifitotii w 1845 r. Podjęto niewiele lub prawie żadnych prób uzyskania odpornych odmian pomidora. Chociaż zaraza późna została po raz pierwszy odnotowana na pomidorach już w 1848 r., Nie stała się przedmiotem poważnej uwagi hodowców tej rośliny aż do silnego wybuchu choroby w 1946 r. Na terytorium Rosji zaraza pomidora została zarejestrowana w XIX wieku. „Przez długi czas badacze nie zwracali uwagi na tę chorobę, ponieważ nie spowodowała ona znaczących szkód ekonomicznych. Ale w latach 60. i 70. XX-wieczne epifitoty zarazy pomidora obserwuje się także w Związku Radzieckim, głównie w regionie Dolnej Wołgi, na Ukrainie, na Kaukazie Północnym, w Mołdawii ... ”(Balashova, 1979).
Od tego czasu inwazja zarazy pomidora przez zarazy następowała corocznie, rozprzestrzeniając się na całym obszarze upraw przemysłowych i domowych, powodując ogromne straty ekonomiczne tej uprawy. Co się stało? Dlaczego pierwsze pojawienie się pasożyta na ziemniakach i zmiana epifitotyczna tej kultury wystąpiły prawie jednocześnie, podczas gdy epifitoza pojawiła się na pomidorach po stuleciu? Te różnice potwierdzają raczej meksykańskie niż południowoamerykańskie źródło infekcji. Jeśli gatunek Phytophthora infestans powstał jako pasożyt meksykańskich gatunków bulw z rodzaju Solanum, to zrozumiałe jest, dlaczego uprawiane ziemniaki należące do tej samej sekcji rodzaju co gatunek meksykański były tak silnie dotknięte, ale ze względu na brak koewolucji z pasożytem, który nie rozwinął mechanizmów swoistej i niespecyficznej odporności.
Pomidor należy do innej sekcji rodzaju, rodzaj jego wymiany znacznie różni się od gatunków bulwiastych, dlatego pomimo tego, że pomidor nie jest poza specjalizacją pokarmową P. infestans, intensywność jego uszkodzeń była niewystarczająca do poważnych strat ekonomicznych.
Pojawienie się epifitotii na pomidorze jest spowodowane poważnymi zmianami genetycznymi pasożyta, które zwiększyły jego przydatność (patogeniczność) podczas pasożytnictwa. Uważamy, że nową formą wyspecjalizowaną w pasożytowaniu pomidora jest rasa T1 opisana przez M. Gallegly'ego, wpływająca na odmiany pomidora cherry (Red Cherry, Ottawa), odporne na rasę T0 szeroko rozpowszechnioną na ziemniakach (Gallegly, 1952). Najwyraźniej mutacja (lub seria mutacji), która zmieniła rasę T0 w rasę T1 i doprowadziła do pojawienia się klonów wysoce przystosowanych do pokonania pomidora. Jak to często bywa, wzrostowi chorobotwórczości u jednego żywiciela towarzyszył jej spadek u innego, to znaczy powstała początkowa, jeszcze niepełna specjalizacja wewnątrzgatunkowa - ziemniaki (rasa T0) i pomidory (rasa T1).
Jakie są dowody na to założenie?
- Występowanie na ziemniakach i pomidorach. Na liściach pomidora dominuje rasa T1, na liściach ziemniaka występuje rzadko. Według S.F. Bagirova i T.A. Oreshonkova (niepublikowane) w regionie moskiewskim w latach 1991-1992 występowanie rasy T1 w nasadzeniach ziemniaków wyniosło 0%, a na sadzonkach pomidorów - 100%; w latach 1993-1995 - odpowiednio 33% i 90%; w 2001 roku - 0% i 67%. Podobne dane uzyskano w Izraelu (Cohen, 2002). Doświadczenia z infekcją bulw ziemniaka izolatami rasy T1 i mieszaniną izolatów T0 i T1 wykazały, że izolaty rasy T1 są słabo zachowane w bulwach i są zastępowane izolatami rasy T0 (Dyakov i in., 1975; Rybakova, 1988).
2) Dynamika rasy T1 w nasadzeniach pomidorów. Pierwotną infekcję liści pomidora przeprowadzają izolaty rasy T0, które dominują w analizie infekcji w pierwszych plamkach powstałych na liściach. Potwierdza to ogólnie przyjęty schemat migracji pasożytów: główną masę infekcji z ziemniaków tworzy rasa T0, jednak niewielka liczba klonów T1 zachowanych w ziemniakach, raz na pomidorach, wypiera rasę T0 i gromadzi się pod koniec okresu epifitotycznego. Możliwe jest również, że istnieje alternatywne źródło infekcji liści pomidora rasą T1, nie tak silne jak bulwy i liście ziemniaka, ale stałe. Dlatego to źródło ma słaby wpływ na strukturę genetyczną populacji zarażającej pomidora, ale następnie determinuje akumulację rasy T1 (Rybakova, 1988; Dyakov i in., 1994).
3) Agresywność wobec ziemniaków i pomidorów. Sztuczna infekcja pomidora i liści ziemniaka izolatami ras T0 i T1 wykazała, że te pierwsze są bardziej agresywne dla ziemniaków niż dla pomidorów, a te drugie są bardziej agresywne dla pomidorów niż dla ziemniaków. Różnice te przejawiają się w wypieraniu izolatów rasy innej niż „własna” z populacji mieszanej podczas przejazdów liści w szklarni (D'yakov i in., 1975) oraz na poletkach (Leberton i in., 1999); różnice w minimalnym obciążeniu infekcyjnym, okresie utajenia, wielkości plam zakaźnych i produkcji zarodników (Rybakova, 1988; Dyakov i wsp., 1994; Legard i wsp., 1995; Forbes i wsp., 1997; Oyarzun i wsp., 1998; Leberton i wsp. in., 1999; Vega-Sanchez i in., 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna i in., 2004).
Agresywność izolatów rasy T1 w stosunku do odmian pomidorów pozbawionych genów odporności jest tak duża, że izolaty te zarodnikują na liściach jak na pożywce bez nekrotyzacji zakażonej tkanki (Dyakov i in., 1975; Vega-Sanchez i in., 2000).
4) Zjadliwość dla ziemniaków i pomidorów. Rasa T1 atakuje odmiany pomidorów cherry z genem odporności Ph1, natomiast rasa T0 nie jest zdolna do infekowania tych odmian, tj. ma węższą zjadliwość. W odniesieniu do wyróżników
Geny R ziemniaków są odwrotnie powiązane, tj. szczepy wyizolowane z liści pomidora są mniej zjadliwe niż szczepy „ziemniaka” (Tabela 11).
5) Neutralne markery. Analiza markerów neutralnych w populacjach P. infestans pasożytujących na ziemniakach i pomidorach również świadczy o wielokierunkowej selekcji wewnątrzgatunkowej. W brazylijskich populacjach P. infestans izolaty liści pomidora należały do linii klonalnej US-1, a te z liści ziemniaka do linii BR-1 (Suassuna i in., 2004). Na Florydzie (USA) od 1994 roku klon US-90 zaczął dominować na ziemniakach (z występowaniem ponad 8%), a klony US-11 i US-17 na pomidorach, a te ostatnie są bardziej agresywne dla pomidora niż dla ziemniaka (Weingartner , Tombolato, 2004). Istotne różnice w częstości występowania genotypów (odcisków palców DNA) w izolatach ziemniaka i pomidora ustalono dla 1200 szczepów P. infestans zebranych w Stanach Zjednoczonych w latach 1989-1995 (Deahl i wsp., 1995).
Metoda AFLP pozwoliła na wyodrębnienie 74 szczepów zebranych z liści ziemniaka i pomidora w latach 1996-1997. we Francji i Szwajcarii w 7 grupach. Odmiany ziemniaka i pomidora nie różniły się wyraźnie, ale odmiany „ziemniaka” były bardziej zróżnicowane genetycznie niż odmiany „pomidorowe”. Pierwsze stwierdzono we wszystkich siedmiu skupieniach, a drugie tylko w czterech, co wskazuje na bardziej wyspecjalizowany genom drugiego (Knapova i Gisi, 2002).
6) Mechanizmy izolacji. Jeśli populacje pasożyta na dwóch gatunkach roślin żywicielskich ewoluują w kierunku zawężenia specjalizacji w kierunku „własnego” żywiciela, wówczas powstają różne mechanizmy pre- i postmeiotyczne, które uniemożliwiają międzypopulacyjne wymiany genetyczne (Dyakov i Lekomtseva, 1984).
W kilku badaniach zbadano wpływ źródła szczepów rodzicielskich na wydajność hybrydyzacji. Podczas krzyżowania szczepów izolowanych z różnych gatunków z rodzaju Solanum w Ekwadorze (Oliva et al., 2002) stwierdzono, że szczepy z kojarzeniem typu A2 z dzikich Solanaceae (linia klonalna EC-2) są najgorzej krzyżowane ze szczepami pomidora (linia EC -3) i najskuteczniej krzyżowany ze szczepem ziemniaka (EC-1).
Wszystkie hybrydy okazały się niepatogenne. Autorzy uważają, że niski odsetek hybrydyzacji i zmniejszenie patogenności u mieszańców są spowodowane postmeiotycznymi mechanizmami izolacji reprodukcyjnej populacji.
W doświadczeniach Bagirovej i wsp. (1998) krzyżowano dużą liczbę odmian ziemniaka i pomidora z właściwościami ras T0 i T1. Najbardziej płodne krzyżówki szczepów T1xT1 wyizolowanych z pomidora (36 oospor w polu widzenia mikroskopu, 44% kiełkowania oospor), najmniej efektywne były krzyżówki ras T0xT1 wyizolowanych z różnych żywicieli (mała liczba rozwijających się i kiełkujących oospor, duży udział nieudanych i słabo rozwiniętych oospor) ... Skuteczność krzyżówek pomiędzy izolatami rasy T0 wyizolowanymi z ziemniaków była pośrednia. Ponieważ główny korpus szczepów rasy T0 oddziałuje na ziemniaki, ma on wiarygodne źródło zimowania - bulwy ziemniaka, w wyniku czego znaczenie oospor jako zimujących jednostek zakaźnych dla populacji ziemniaków jest niskie. Zaadaptowana „forma pomidora” jest w stanie zimować na pomidorze w postaci oospor (patrz poniżej), a zatem zachowuje wyższą produktywność procesu płciowego. Ze względu na wysoką płodność T1 uzyskuje niezależny potencjał pierwotnej infekcji pomidora. Wyniki uzyskane przez Knapovę i wsp. (Knapova i wsp., 2002) można interpretować w ten sam sposób. Krzyżówki szczepów wyizolowanych z ziemniaków ze szczepami pomidora dały największą liczbę oospor - 13,8 / mm5. średni (z rozrzutem 19-6,3) i pośrednim procentem kiełkowania oospor (0 z rozrzutem 24-7,6). Skrzyżowania szczepów wyizolowanych z pomidora dały najmniejszy procent oospor (4 z rozprzestrzenianiem się 12-10,8) przy najwyższym odsetku ich kiełkowania (8,6). Krzyżówki pomiędzy szczepami wyizolowanymi z ziemniaków dały pośrednią liczbę oospor (0 z dużym rozrzutem danych - 30-2,7) i najniższy procent kiełkowania oospor (90). Tak więc szczepy ziemniaków są mniej płodne niż te z pomidorów, ale krzyżówki międzypopulacyjne nie dawały gorszych wyników niż krzyżówki wewnątrzpopulacyjne. Niewykluczone, że różnice z powyższymi danymi Bagirovej i wsp. wyjaśniają fakt, że rosyjscy badacze pracowali ze szczepami wyizolowanymi na początku lat 90. XX wieku, a naukowcy szwajcarscy - z szczepami wyizolowanymi pod koniec lat XNUMX.
Podstawą niskiej płodności może być heteroploidia szczepów. Jeżeli w populacjach meksykańskich, gdzie proces płciowy i pierwotne zakażenie potomstwem oosporowatym są regularne, większość badanych szczepów P. Infestans jest diploidalna, to w krajach Starego Świata obserwuje się wewnątrzpopulacyjny polimorfizm ploidii (szczepy di-, tri- i tetraploidalne, a także szczepy heterokariotyczne z jądrem heteroploidalnym) i szczepy posiadające różne typy krycia, tj. wzajemnie płodne, różnią się ploidią jądrową (Therrien i wsp., 1989, 1990; Whittaker i wsp., 1992; Ritch, Daggett, 1995). Różnorodność jąder pylników i oogonii może być przyczyną niskiej płodności.
Jeśli chodzi o wymianę jąder między strzępkami podczas zespoleń, zapobiega temu niezgodność wegetatywna, która rozbija populacje bezpłciowe na wiele klonów izolowanych genetycznie (Poedinok i Dyakov, 1987; Gorbunova i in., 1989; Anikina i in., 1997b).
7) Konwergencja populacji. Powyższe dane wskazują, że możliwa jest hybrydyzacja pomiędzy szczepami P. infestans „ziemniak” i „pomidor”. Możliwe jest również wzajemne zakażenie różnych żywicieli, aczkolwiek ze zmniejszoną agresywnością.
Badanie markerów populacji izolatów z sąsiednich pól ziemniaków i pomidorów w 1993 roku wykazało, że około jedna czwarta izolatów wyizolowanych z liści pomidora została przeniesiona z sąsiedniego pola ziemniaka (Dolgova i in., 1997). Teoretycznie można założyć, że dywergencja populacji na dwóch żywicielach zwiększyłaby się i doprowadziłaby do pojawienia się wyspecjalizowanych form wewnątrzgatunkowych (np. Ziemniaka i f.sp. Pomidora), zwłaszcza że oospory mogą przetrwać w resztkach roślinnych (Drenth et al., 1995 ; Bagirova, Dyakov, 1998) i nasiona pomidorów (Rubin i in., 2001). W konsekwencji pomidory są obecnie źródłem regeneracji wiosennej niezależnej od bulw ziemniaka.
Jednak wszystko stało się inaczej. Zimowanie z oosporami pozwoliło pasożytowi uniknąć najwęższego etapu cyklu życiowego - monocyklicznego etapu wegetacji w glebie, podczas którego właściwości pasożytnicze ulegają stopniowej odbudowie w fazie policyklicznej latem.
Tabela 11. Częstości występowania genów wirulencji wobec odmian różnicujących ziemniaka w szczepach P. infestans
kraj | Rok | Średnia liczba genów wirulencji w szczepach | autor | |
z ziemniaków | z pomidora | |||
Francja | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton i in., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Francja, Szwajcaria | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapowa, Gisi, 2002 |
Stany Zjednoczone | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin i in., 1995 |
Stany Zjednoczone, Zap. Waszyngton | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance i in., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ekwador | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun i in., 1998 |
Izrael | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Rosja, Mosk. region | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Rosja, różne regiony | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaya i inni. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Pierwotne zoosporangie i zoospory, które kiełkują oospory, wykazują wysoki stopień aktywności pasożytniczej, zwłaszcza jeśli oospory powstały partenogenetycznie pod wpływem feromonów szczepu o przeciwnych typach kojarzenia. Dlatego materiał zakaźny na sadzonkach pomidorów wyhodowanych z nasion zainfekowanych oosporami jest wysoce patogenny zarówno dla pomidora, jak i ziemniaka.
Zmiany te doprowadziły do kolejnej restrukturyzacji populacji, wyrażającej się następującymi istotnymi zmianami z epidemiologicznego punktu widzenia:
- Zainfekowane sadzonki pomidorów stały się ważnym źródłem pierwotnej infekcji ziemniaków (Filippov, Ivanyuk, osobiste wiadomości).
- Epifitoty na ziemniakach zaczęto obserwować już w czerwcu, około miesiąc wcześniej niż zwykle.
- W sadzonkach ziemniaków wzrósł odsetek rasy T1, która wcześniej występowała tam w znikomej ilości (Ulanova i in., 2003).
- Szczepy wyizolowane z liści pomidora przestały różnić się od szczepów ziemniaka zjadliwością na ziemniakach różnicujących genach wirulencji i zaczęły przewyższać szczepy „ziemniaka” agresywnością nie tylko na pomidorach, ale także na ziemniakach (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al. , 2003).
Tak więc zamiast rozbieżności nastąpiła konwergencja populacji, pojawienie się jednej populacji na dwóch roślinach żywicielskich o wysokiej zjadliwości i agresywności dla obu gatunków.
wniosek
Tak więc, pomimo ponad 150 lat intensywnych badań nad P. infestans, w biologii, w tym biologii populacji tego czynnika wywołującego najważniejsze choroby uprawianych roślin psiankowatych, wiele pozostaje nieznanych. Nie jest jasne, jak przebieg poszczególnych etapów cyklu życiowego wpływa na strukturę populacji, jakie są mechanizmy genetyczne kanalizowanej zmienności agresywności i zjadliwości, jaki jest stosunek systemów reprodukcyjnych i klonalnych w populacjach naturalnych, jak dziedziczona jest niezgodność wegetatywna, jaka jest rola ziemniaków i pomidorów w pierwotnej infekcji tych upraw oraz w jaki jest ich wpływ na strukturę populacji pasożytów. Jak dotąd nie rozwiązano tak ważnych kwestii praktycznych, jak mechanizmy genetyczne zmiany agresywności pasożyta czy erozja niespecyficznej odporności ziemniaka. Wraz z pogłębianiem się i rozszerzaniem badań nad zarazą ziemniaka, pasożyt stawia naukowcom nowe wyzwania. Jednak poprawa możliwości eksperymentalnych, pojawienie się nowych metodologicznych podejść do manipulacji genami i białkami pozwala mieć nadzieję na pomyślne rozwiązanie postawionych pytań.
Artykuł został opublikowany w czasopiśmie „Potato Protection” (nr 3, 2017)