D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Fitopatogenny grzyb Colletotrichum coccodes powoduje niebezpieczne choroby ziemniaków i pomidorów znane jako antraknoza i czarna plamistość bulw. Ze względu na cechy morfologiczne często trudno je odróżnić od chorób wywoływanych przez inne mikroorganizmy; na owocach zielonych pomidorów choroba może przebiegać bezobjawowo, objawiając się tylko na dojrzałych czerwonych owocach. W celu szybkiej i dokładnej diagnozy patogenu oferowany jest system testów PCR w czasie rzeczywistym. Aby opracować system testowy, określono sekwencję nukleotydów genu dehydrogenazy glicerolu trifosforanu 45 szczepów C. coccodes wyizolowanych z bulw ziemniaka w różnych regionach Rosji.
Na podstawie uzyskanych wyników i analizy podobnych sekwencji innych gatunków dostępnych w bazie danych GenBank zaprojektowano gatunkowe startery i sondę dla C. coccodes. W celu sprawdzenia specyfiki stworzonego systemu testowego przeprowadzono PCR z DNA wyizolowanym z czystych kultur 15 różnych gatunków grzybów pasożytniczych i saprotroficznych związanych z pomidorami i roślinami ziemniaka (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Obecność DNA Colletotrichum coccodes określono w cyklu progowym 20–27, podczas gdy inne gatunki wykryto po 40 cyklach lub nie wykryto. System testowy umożliwia wiarygodne wykrycie stężenia DNA C. coccodes przekraczającego 0.01 ng / mm3 w analizowanej mieszaninie PCR. Wykorzystując opracowany system testowy zbadano obecność C. coccodes w liściach pomidora z objawami chorób grzybowych oraz w bulwach ziemniaka bez zewnętrznych objawów choroby. Liście z objawami infekcji grzybiczej zebrano z dwóch różnych pól na terytorium Krasnodaru, bulwy - z pól w regionach Kostroma, Moskwa, Kaługa, Niżny Nowogród. Na terytorium Krasnodaru znaleziono jeden liść pomidora zawierający DNA C. coccodes; znaczącą obecność DNA tego patogenu wykryto w 5 próbkach bulw wyhodowanych w regionach Kostroma, Moskwa, Kaługa.
Wprowadzenie
Grzyby z rodzaju Colletotrichum to niebezpieczne fitopatogeny atakujące zboża, warzywa, zioła, wieloletnie rośliny owocowe i jagodowe. Jeden z wszechobecnych gatunków tego rodzaju, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, jest czynnikiem wywołującym antraknozę i czarną plamkę ziemniaków i pomidorów oraz powoduje choroby wielu innych roślin z rodziny Solanaceae, m.in. chwasty (Dillard, 1992). C. coccodes infekuje wszystkie podziemne części rośliny, podstawy łodyg, liście i owoce (Andrivon i in., 1998; Johnson, 1994). Na skórce porażonych bulw ziemniaka obserwuje się rozwój szarych plam o niewyraźnie zaznaczonych krawędziach, na których wyraźnie widoczne są czarne plamki zarodnikowania i mikrosklerocjów. Podczas przechowywania w miazdze bulw mogą powstawać wrzody ze zmiękczoną zawartością, tj. choroba wchodzi w fazę antraknozy, która jest jednak niezwykle rzadka.
Jednocześnie objawy antraknozy (owrzodzenia skóry z małymi czarnymi kropkami) są typowe dla owoców pomidora. Na liściach objawy C. coccodes pojawiają się jako ciemnobrązowe plamy, zwykle otoczone żółtą tkanką (Johnson, 1994).
Pojawienie się czarnej plamki na bulwach psuje ich wygląd, co jest szczególnie widoczne w przypadku sprzedaży umytych ziemniaków z czerwoną skórką. Złuszczanie skórki prowadzi do nadmiernego parowania i zwiększonych strat podczas przechowywania (Hunger, McIntyre, 1979). Uszkodzenie innych organów roślin prowadzi do strat plonu, które odnotowano zarówno na gruncie otwartym, jak i zamkniętym (Johnson, 1994; Tsror i in., 1999). Choroby wywoływane przez C. coccodes są powszechne w prawie wszystkich regionach produkujących ziemniaki na świecie, w tym w Rosji (Leesa, Hilton, 2003; Belov i in., 2018). Zwalczanie tych chorób jest trudne ze względu na niewystarczającą skuteczność istniejących fungicydów przeciwko C. coccodes i brak odmian odpornych (Read, Hide, 1995).
Inokulum C. coccodes może przetrwać w bulwach nasiennych (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), nasionach pomidora (Ben-Daniel et al., 2010), przeżyć przez długi czas w glebie, na szczątkach roślinnych (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) oraz w chwastach (Raid, Pennypacker, 1987). Prace wielu autorów (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) wykazały, że rozwój choroby ziemniaków i pomidorów w dużej mierze zależy od obecności inokulum w nasionach i gleba. Dlatego też, aby zminimalizować straty spowodowane chorobą, konieczne jest zdiagnozowanie (w tym ilościowe) rozmnażania grzyba w materiale siewnym, w glebie, w bulwach sadzeniaków i nasionach pomidora przeznaczonych do przechowywania. Diagnostykę morfologiczną gleby i materiału roślinnego można przeprowadzić jedynie na podstawie obecności mikrosklerocjów, które jednak spotyka się również w innych rodzajach grzybów.
Objawy na bulwach są bardzo podobne do parcha srebrzystego wywoływanego przez grzyba Helminthosporium solani. Izolacja Colletotrichum coccodes i Helminthosporium solani do czystej kultury jest raczej trudna i zajmuje dużo czasu ze względu na powolny wzrost na pożywce. Aby szybko zidentyfikować coccodes Colletotrichum, konieczne jest zastosowanie instrumentalnych metod diagnostycznych. Najdogodniejszą metodą jest łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) i jej modyfikacja - real-time PCR. Obecnie system testowy opracowany przez brytyjskich naukowców (Cullen i in., 2002) dla regionu ITS1 rDNA jest używany w Europie i Stanach Zjednoczonych. Jego zastosowanie dało dobre wyniki w analizie izolatów rosyjskich (Belov i in., 2018). Jednak C. coccodes jest bardzo zmienny, a jego wykrycie na podstawie pojedynczej sekwencji DNA może prowadzić do wyników fałszywie ujemnych. W celu uzyskania bardziej wiarygodnej diagnozy wymagana jest analiza kilku specyficznych dla gatunku sekwencji DNA, w związku z czym opracowaliśmy oryginalny system testowy, który umożliwia identyfikację C. coccodes na podstawie sekwencji genu dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej.
Materiały i metody
Do oceny skuteczności i swoistości stworzonych systemów testowych wykorzystano czyste kultury 15 gatunków grzybów wyizolowanych przez autorów z chorych próbek liści pomidora i owoców, bulw ziemniaka (tab.1). Do izolacji pobrano organy roślin z objawami infekcji grzybiczej, nie więcej niż jeden organ na krzak.
Kawałek bulwy ze skórką, kawałek owocu pomidora i porażony liść umieszczono pod mikroskopem dwuokularowym, po czym grzybnię, zarodniki lub kawałek tkanki przeniesiono na pożywkę agarową (agar brzeczkowy) na szalce Petriego za pomocą zaostrzonej igły preparacyjnej. Izolaty przechowywano na skosie agaru w probówkach w temperaturze 4 ° C.
Próbki liści pomidora z objawami chorób grzybowych, przeznaczone do analizy, bezpośrednio po pobraniu (w terenie) umieszczono w 70% alkoholu etylowym, w którym przechowywano do momentu izolacji DNA. Do laboratorium dostarczono bulwy ziemniaka, obrane (kawałek 2 × 1 cm) z nich i zamrożone w temperaturze –20 ° С. Przechowywany zamrożony do momentu izolacji DNA.
Czyste kultury grzybów do izolacji DNA hodowano w płynnym podłożu z grochu. Grzybnię grzyba usunięto z pożywki ciekłej, wysuszono na bibule filtracyjnej, zamrożono w ciekłym azocie, homogenizowano, inkubowano w buforze CTAB, oczyszczono chloroformem, wytrącono mieszaniną izopropanolu i 0.5 M octanu potasu, przemyto dwukrotnie 2% alkoholem. Powstały DNA rozpuszczono w wodzie dejonizowanej i przechowywano w temperaturze –70 ° С (Kutuzova i in., 20). Stężenie DNA mierzono za pomocą zestawu do oznaczania ilościowego HS DNA dla dwuniciowego DNA na Qubit 2017 (Qiagen, Niemcy). Alkoholizowane i zamrożone próbki rozciera się w ciekłym azocie, a następnie przeprowadza się ekstrakcję DNA, jak opisano powyżej (dla grzybni czystych kultur grzybów).
Tabela 1. Pochodzenie użytych szczepów grzybów
Nazwa grzyba | Roślina, organy | Miejsce selekcji |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | bulwa ziemniaka | Region Kostroma, bulwy ziemniaka pierwszego pokolenia polowego, odmiana Red Scarlett |
Kokosy Colletotrichum 4 | liść ziemniaka | Reprezentant. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | bulwa ziemniaka | Region Magadan, poz. Namiot, bulwa ziemniaka |
Cladosporium fulvum | liść pomidora | Region moskiewski, wielkoowocowy pomidor |
Alternaria pomidorofila | owoc pomidora | złożone przez pracowników laboratorium mikologii i fitopatologii Wszechrosyjskiego Instytutu Ochrony Roślin |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | owoc pomidora | Terytorium Krasnodarskie, powiat krymski, klasa śmietana |
Fusarium oxysporum | korzeń pszenicy | Region Moskwy |
PCR przeprowadzono na wzmacniaczu DTprime (technologia DNA). Do PCR wykorzystano oryginalne startery i sondę dla specyficznego gatunkowo regionu genu dehydrogenazy trójfosforanowej glicerolu: starter do przodu Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, starter do tyłu Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1. Startery amplifikują region o wielkości 213 bp.
Reakcja zajęła 50 ng całkowitego DNA (w analizie liści i bulw) i 10 ng (w analizie DNA czystych kultur grzybów). Mieszaninę reakcyjną (35 μl) rozdzielono warstwą parafiny na dwie części: dolna (20 μl) zawierała 2 μl 10 x buforu reakcyjnego (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM każdego trifosforanu deoksynukleotydu, 7 pmoli każdego startera i 4 pmol hydrolizowalnej sondy fluorescencyjnej; górna zawierała 1 μl 10x buforu PCR i 1 U polimerazy Taq.
Rozdzielenie mieszaniny parafiną pozwala na długie przechowywanie probówek w temperaturze 5 ° C oraz na gorący start do PCR po 10 minutowym ogrzewaniu w temperaturze powyżej 80 ° C. PCR wykonano według następującego programu: 94.0 ° C - 90 s (1 cykl); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 cykli); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 cykli); 10.0 ° C - przechowywanie.
Wyniki i dyskusja
Sekwencje genów dehydrogenazy trójfosforanowej glicerolu określono w 45 szczepach izolowanych z liści, łodyg, bulw ziemniaka i owoców pomidora (Kutuzova, 2018) w różnych regionach Rosji. Badane sekwencje wszystkich szczepów podzielono na 2 grupy różniące się dwoma nukleotydami. Sekwencje nukleotydowe przedstawicieli obu grup pod numerami KY496634 i KY496635 są zdeponowane w GenBank.
Startery coc70gdf, coc280gdr oraz zaprojektowaną na ich podstawie sondę cocgdz sprawdzono za pomocą programu BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) na wszystkich sekwencjach genu dehydrogenazy trifosforanu glicerolu z gatunku Colletotrichum i innych organizmów dostępnych w bazie danych GenBank.
Nie znaleziono regionów DNA innych organizmów wysoce homologicznych do starterów i sondy.
Czułość systemu testowego sprawdzono na próbkach o różnym stężeniu DNA C. coccodes, DNA liścia ziemniaka zakażonego antraknozą (pobrane w 2017 r. W Mari El, odmiana Red Scarlett) oraz skórki bulw dotkniętych czarną plamką (pobrane w rejonie Kostroma, odmiana Red Scarlett, Tabela 2). Aby potwierdzić obecność DNA w bulwach i liściach ziemniaka, wyizolowano z nich szczepy C. coccodes do czystych kultur.
Wyniki analizy wrażliwości systemu testowego pokazują, że można go z powodzeniem zdiagnozować obecność DNA C. coccodes w próbce, jeśli jego całkowita zawartość w mieszaninie PCR jest większa niż 0.05 ng. Jest to wystarczające do wykrycia, ponieważ jedna sklerocja zawiera średnio 0.131 ng, a jedna zarodnik zawiera około 0.04 ng DNA (Cullen i wsp., 2002). System testowy opracowany przez grupę angielską (Cullen i wsp., 2002) wykazał podobną czułość (cykl progowy 34 przy 0.05 ng DNA i 37 przy 0.005 ng).
Analiza próbek naturalnych zawierających C. coccodes we wszystkich przypadkach pozwoliła wiarygodnie wykryć jego obecność w próbce (tab. 2). Zaproponowana metoda izolacji DNA miała również zastosowanie do analizy próbek roślin naturalnych.
Tabela 2. Określenie czułości proponowanego systemu testowego do identyfikacji coccodes Colletotrichum dla PCR w czasie rzeczywistym
próba | Ilość DNA w próbce *, ng | Cykl progowy | C. wykrywanie coccodes |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Skórka bulw 1 | 50 | 32 | + |
Skórka bulw 2 | 50 | 30 | + |
Skórka bulw 3 | 50 | 31.5 | + |
Liść ziemniaka | 50 | 29.5 | + |
Uwaga. * W mieszaninie produktów PCR.
Specyfika systemu testowego została przetestowana na próbkach DNA wyekstrahowanych z 15 gatunków grzybów. Wszystkie szczepy grzybów autorzy wyizolowali z porażonych i zdrowych owoców oraz liści pomidora, bulw ziemniaka; jeden szczep został wyizolowany z korzenia pszenicy (Tabela 1). Wśród gatunków izolowanych z powierzchni owocu są również gatunki, które nie są chorobotwórcze dla pomidora (np. Phellinus ferrugineovelutinus).
Badania wykazały, że DNA C. coccodes wykryto w cyklu progowym 20–27, podczas gdy inne gatunki grzybów nie zostały wykryte lub dały sygnał po 40 cyklu, co można przypisać niespecyficznemu efektowi szumu (Tabela 3).
Tabela 3. Sprawdzenie systemu badawczego dla różnych rodzajów grzybów
Nazwa grzyba | Cykl progowy |
Kokosy Colletotrichum 1 | 20.9 |
C. kokody 2 | 22.6 |
C. kokody 3 | 23 |
C. kokody 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis Phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. pomidorofila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Akrodont luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Uwaga. * Ilość DNA we wszystkich próbkach wynosiła 10 ng.
Opracowany system testowy posłużył do identyfikacji C. coccodes w próbkach liści pomidora z objawami patogenów nekrotroficznych i bulw sadzeniaków bez widocznych objawów. Do badania wzięliśmy bulwy nasienne różnych odmian uprawianych w regionach Kostroma, Moskwie, Kałudze, Niżnym Nowogrodzie. Obecność DNA C. coccodes uznano za znaczącą w próbkach, w analizie których cykl progowy nie przekroczył 35. Wartość progową wybrano na podstawie wiarygodnego oznaczenia 0.05 ng DNA C. coccodes (cykl progowy 33.5, tabela 2) oraz fakt, że cykle progowe powyżej 40, zdiagnozowano niespecyficzne DNA innych gatunków grzybów. Dzięki temu podejściu znaczącą obecność DNA C. coccodes wykryto w 5 próbkach bulw wyhodowanych w regionach Kostroma, Moskwie, Kałudze oraz w jednym liściu pomidora z okręgu Yeisk w regionie Krasnodar (Tabele 4, 5).
Tabela 4. Wykrywanie coccodes Colletotrichum na bulwach ziemniaka *
Numer próbki | Różnorodność ziemniaków | Miejsce wzrostu | C. wykrywanie coccodes | Cykl progowy |
---|---|---|---|---|
1 | Red Scarlet | Region Kostroma | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Region Moskwy | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Żukowski wcześnie | Region Moskwy | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | regionu Kaluga. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Fantazja | regionu Kaluga. | - | |
15 | Gala | Region Niżny Nowogród. | - | |
16 | - |
Uwaga. * Ilość DNA we wszystkich próbkach wynosiła 50 ng.
Tabela 5. Wykrywanie coccodes Colletotrichum na liściach pomidora *
Numer próbki | Miejsce wzrostu | C. wykrywanie coccodes | Cykl progowy |
---|---|---|---|
1 | Terytorium Krasnodarskie, dystrykt krymski | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Terytorium Krasnodar, dystrykt Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Ilość DNA we wszystkich próbkach wynosiła 50 ng.
Stworzony przez nas system testowy pod względem czułości i swoistości nie ustępuje systemowi opracowanemu przez brytyjskich badaczy (Cullen et al., 2002) i nadaje się do analizy próbek roślin. Jego zastosowanie do analizy bulw nasiennych umożliwiło identyfikację DNA C. coccodes w bulwach bez zewnętrznych oznak uszkodzeń oraz skuteczną analizę porażenia liści.
Jak dotąd w Rosji nie przeprowadzono analizy bulw ziemniaka pod kątem porażenia C. coccodes. Nasze pierwsze badanie wykazało, że z 16 przebadanych bulw nasiennych wyhodowanych w różnych regionach Federacji Rosyjskiej 5 zawiera C. coccodes. To pokazuje, że czarna plama bulw ziemniaka jest powszechną chorobą ziemniaka w Rosji, a jej rola w zmniejszaniu wielkości i jakości plonów ziemniaka jest niedoceniana.
Analiza liści pomidora wykazała znaczną obecność DNA C. coccodes w jednym liściu z okręgu Yeisk na terytorium Krasnodar. Wcześniej, badając pola pomidorów w południowej Rosji za pomocą brytyjskiego systemu testowego (Cullen i in., 2002), stwierdzono liście zawierające C. coccodes, a na niektórych polach stwierdzono wysoki odsetek liści porażonych C. coccodes (Belov i in., 2018). Na Terytoriach Krasnodarskich i Primorskich, w obwodzie moskiewskim, znaleźliśmy owoce pomidora, z których udało nam się wyizolować czyste kultury C. coccodes. Możliwe, że C. coccodes jest znacznie bardziej rozpowszechniony na pomidorach w Rosji, niż się obecnie uważa, a jego szkodliwość jest również niedoceniana.
Tak więc do tej pory zgromadzono wystarczające informacje na temat powszechnego rozmieszczenia C. coccodes na ziemniakach i pomidorach.
Aby lepiej zrozumieć rolę tego grzyba w rozwoju chorób ziemniaka i pomidora, konieczne jest monitorowanie jego rozpowszechnienia w Rosji, badanie roli infekcji gleby i nasion oraz roli czarnej plamki w stratach podczas przechowywania. Zastosowanie diagnostyki PCR może znacznie ułatwić tę pracę, a jednoczesne stosowanie obu systemów testowych znacznie zwiększy dokładność analizy.
Praca została sfinansowana z grantu Rosyjskiej Fundacji Nauki nr 18-76-00009.
Artykuł został opublikowany w czasopiśmie „Mycology and Phytopathology” (tom 54, nr 1, 2020).