JEŚĆ. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Niedawno wykazano, że grzyb workowaty Ilyonectria crassa jest zdolny do zakażania bulw ziemniaka. Niniejsza praca jest pierwszą, w której przeanalizowano cechy biologiczne i odporność na niektóre fungicydy szczepu I. crassa wyizolowanego z ziemniaków. Sekwencje regionów specyficznych gatunkowo szczepu „ziemniaka” pokrywały się z uzyskanymi wcześniej dla grzybów wyizolowanych z korzeni żonkila, żeń-szenia, osiki i buka, cebul lilii i liści tulipana. Wygląda na to, że wiele roślin dzikich i ogrodowych może być rezerwatem I. crassa. Badany szczep zainfekował plastry pomidora i ziemniaka, ale nie spowodował zakażenia całego owocu pomidora i nienaruszonej bulwy ziemniaka. To pokazuje, że I. crassa jest pasożytem na rany. Ocena oporności na fludioksonil, difenokonazol i azoksystrobinę na pożywce wykazała wysoką skuteczność tych leków.
Wskaźnik EC50 (stężenie fungicydu, które spowalnia 2-krotność tempa wzrostu promieniowego kolonii w stosunku do kontroli niegrzybobójczej) wyniósł 0.4; Odpowiednio 7.4 i 4 mg / l. Możliwość rozwoju choroby wywoływanej przez I. crassa powinna być brana pod uwagę przy ocenie fitopatologicznej bulw ziemniaka i opracowywaniu środków ochrony roślin.
Rozwój mikroorganizmów fitopatogennych prowadzi do dużych strat na wszystkich etapach uprawy i przechowywania ziemniaków. Przy planowaniu działań ochronnych z reguły bierze się pod uwagę dobrze znane patogeny, takie jak gatunki z rodzajów Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora itp. Jednak w ostatnich latach pojawia się coraz więcej doniesień o pojawianiu się nowych fitopatogennych mikroorganizmów na ziemniakach. Ich biologia jest słabo zbadana, skuteczność fungicydów stosowanych na ziemniakach w stosunku do nich jest nieznana, nie opracowano metod diagnostycznych. Dzięki masowemu rozwojowi są w stanie spowodować znaczne szkody w uprawie ziemniaka. Jednym z tych mikroorganizmów jest grzyb workowaty Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, po raz pierwszy odkryty przez autorów na bulwach ziemniaka (Chudinova et al., 2019).
W pracy przedstawiono wyniki analizy szczepu I. crassa wyizolowanego z bulw ziemniaka. Badano morfologię kolonii i struktury grzybni I. crassa, sekwencje nukleotydów specyficznych dla gatunku regionów DNA, wirulencję ziemniaków i pomidorów oraz odporność na niektóre popularne fungicydy.
Materiały i metody
Użyliśmy szczepu I. crassa 18KSuPT2 wyizolowanego w 2018 roku z zakażonej bulwy ziemniaka uprawianej w regionie Kostroma. Na bulwę wystąpiła sucha zgnilizna z jamą pokrytą jasnobrązową grzybnią. Przy użyciu jałowej igły do preparowania grzybnię przenoszono na szalkę Petriego z pożywką agarową (brzeczka piwna 10%, agar 1.5%, penicylina 1000 U / ml). Płytki inkubowano w ciemności w 24 ° C.
Mikroskop świetlny Leica DM2500 z cyfrową kamerą ICC50 HD i dwuokularowy mikroskop Leica M80 z cyfrową kamerą IC80HD (Leica Microsystems, Niemcy) wykorzystano do fotografowania, oceny wielkości i morfologii zarodników i organów zarodników.
Aby wyizolować DNA, grzybnię hodowano w ciekłym podłożu grochowym, następnie zamrażano w ciekłym azocie, homogenizowano, inkubowano w buforze CTAB, oczyszczano chloroformem i przemywano dwukrotnie 2% alkoholem.
Metoda ekstrakcji DNA została szczegółowo opisana w artykule Kutuzovej i wsp. (2017).
Aby określić gatunek metodami molekularnymi i porównać z innymi znanymi szczepami I. crassa, przeprowadzono PCR ze starterami, które pozwoliły na amplifikację specyficznych dla gatunku regionów DNA: ITS1-5,8S-ITS2 (startery ITS5 / ITS4, White i wsp., 1990), regiony genów b -tubulina (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) i współczynnik wydłużenia translacji 1α (tef1α) (startery EF1-728F / EF1-986R, Carbone i Kohn, 1999). Amplikony o żądanej długości wyekstrahowano z żelu przy użyciu zestawu Evrogen CleanUp. Amplifikowane regiony sekwencjonowano przy użyciu zestawu BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) na automatycznym sekwenatorze Applied Biosystems 3730 xl (Applied Biosystems, CA, USA). Uzyskane sekwencje nukleotydów wykorzystano do wyszukania dopasowania w bazie danych GenBank US National Center for Biotechnology Information (NCBI). Analizę filogenetyczną przeprowadzono za pomocą programu MEGA 6 (Tamura i in., 2013).
Określenie zjadliwości przeprowadzono na całych zielonych owocach pomidora wielkoowocowego (odmiana Dubrava) i bulwach ziemniaka (odmiana Gala). Ponadto, aby zasymulować uszkodzenia uszkodzonych owoców i bulw, użyliśmy plasterków tych samych owoców i bulw. Plastry bulw umieszczono w wilgotnych komorach, które były szalkami Petriego z wilgotną bibułą filtracyjną na dnie. Na papierze umieszczano szkiełko, na którym z kolei układano plasterki bulw lub owoców. Całe bulwy i owoce umieszczono również w pojemnikach z wilgotną bibułą filtracyjną na dnie. Pośrodku plastra (lub na nienaruszonej powierzchni bulwy lub owocu) po 5 dniach uprawy na agarze brzeczkowym umieszczono kawałek agaru (5 × 5 mm) ze strzępkami grzybów.
Ocenę odporności szczepów grzybów na fungicydy przeprowadzono w warunkach laboratoryjnych na pożywce agarowej. Badaliśmy wrażliwość na leki grzybobójcze Maxim, KS (aktywny składnik fludioksonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoksystrobina 250 g / l), Scor, EC (difenokonazol 250 g / l) (katalog stanowy ..., 2020). Ocenę przeprowadzono na szalkach Petriego na pożywce brzeczkowo-agarowej z dodatkiem badanych leków w stężeniu substancji czynnej 0.1; jeden; 1 ppm (mg / l) (dla fludioksonilu i difenokonazolu), 10; dziesięć; 1 ppm (dla azoksystrobiny) oraz w pożywkach bez fungicydu (kontrola). Fungicyd dodano do stopionej i schłodzonej do 10 ° C pożywki, po czym wlano ją na szalki Petriego. Blok agaru z grzybnią grzybów umieszczono na środku szalki Petriego i hodowano w ciemności w temperaturze 100 ° C. Po 60 dniach inkubacji zmierzono średnice kolonii w dwóch wzajemnie prostopadłych kierunkach; wyniki pomiarów dla każdej kolonii uśredniono. Eksperymenty przeprowadzono trzykrotnie. Na podstawie wyników analiz obliczono EC24, równe stężeniu fungicydu, które zmniejszyło o połowę szybkość promienistego wzrostu kolonii w stosunku do kontroli grzybobójczej.
Wyniki i dyskusja
Na szalkach Petriego z agarem brzeczkowym grzyby tworzyły kolonie z białą kłaczkowatą grzybnią. Podłoże pod grzybnią stało się czerwono-brązowe. Po wyschnięciu pożywki grzyb utworzył zarodniki dwóch typów na pojedynczych i zagregowanych konidioforach w małych sporodochiach. Makrokonidia są wydłużone, cylindryczne, z jedną do trzech przegród, średnia długość 27.2 µm o zakresie wartości od 23.2 do 32.2 µm, szerokość - do 4.9 µm (ryc. 1). Średnia długość mikrokonidiów wynosi 14.3 µm przy zakresie wartości od 10.3 do 18.1 µm, szerokość do 4.0 µm. Wszystkie cechy makro- i mikromorfologiczne mieszczą się w zakresie zmienności gatunku Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Sekwencje regionów DNA specyficznych dla gatunku (ITS, b-tubulina, TEF 1α) całkowicie pokrywały się z sekwencjami badanych wcześniej szczepów I. crassa (Chudinova i wsp., 2019, tabela 1). W celu zbadania rozpowszechnienia I. crassa w innych regionach i analizy spektrum zakażonych kultur, przeanalizowano podobne sekwencje DNA w bazie danych GenBank (Tabela 1). Nakładanie się wynosiło od 86 do 100%. Sekwencje wszystkich trzech regionów DNA szczepu I. crassa „ziemniaka” były identyczne z sekwencjami szczepów wyizolowanych z cebulki lilii i korzeni narcyza w Holandii oraz z korzenia żeń-szenia w Kanadzie. Nie mogliśmy znaleźć innych szczepów I. crassa z trzema analizowanymi analogicznymi sekwencjami w otwartych bazach danych. Jednak analiza zdeponowanych sekwencji ITS i b-tubuliny wykazała obecność I. crassa na liściach tulipanów w Wielkiej Brytanii. Grzyby o podobnej sekwencji ITS zidentyfikowano podczas analizy mikobioty korzeni osiki w Kanadzie i korzeni buka we Włoszech oraz bulw ziemniaka w Arabii Saudyjskiej (Tabela 1). Wyniki tego badania pokazują, że I. crassa ma zasięg globalny i jest zdolny do zakażania różnych gatunków roślin.
Przy określaniu chorobotwórczości na plastrach pomidora i ziemniaka 5 dnia średnica zmiany sięgała 1.5 cm Badany szczep nie infekował całego owocu pomidora i nienaruszonej bulwy ziemniaka. Jednak działki działek pomidora zostały dotknięte. Aby wykluczyć możliwość zakażenia, izolat grzybowy z grzybni wytworzonej na kawałku bulwy ziemniaka został wyizolowany do czystej kultury. Był całkowicie identyczny z rodzicielskim szczepem. Najwyraźniej I. crassa jest pasożytem rany.
Zaprawianie bulw nasiennych fungicydami przed sadzeniem ogranicza rozwój chorób roślin w okresie wegetacji. Przy wyborze skutecznych fungicydów ważne jest, aby ocenić, które z nich są skuteczne przeciwko I. сrassa. W pracy zbadano szeroko rozpowszechnione substancje czynne fungicydów - fludioksonil, azoksystrobinę, difenokonazol. Fludioxonil jest formułowany w kilku mieszankach stosowanych do zaprawiania nasion i bulw przed sadzeniem. Fludioxonil (Maxim) jest również stosowany do zaprawiania bulw nasion przed przechowywaniem. Difenokonazol i azoksystrobina wchodzą również w skład szeregu preparatów stosowanych do obróbki materiału siewnego, a także preparatów przeznaczonych do przetwarzania roślin wegetatywnych (katalog stanowy…, 2020).
Tempo wzrostu I. crassa badano na pożywkach (ryc. 2) z różnymi stężeniami substancji czynnych: fludioksonilu (EC50 = 0.4 ppm), azoksystrobiny (EC50 = 4 ppm) i difenokonazolu (EC50 = 7.4 ppm) (tab. 2). Preparaty te można uznać za wysoce skuteczne przeciwko I. crassa, ponieważ ich EC50 jest znacznie niższe niż zalecane stężenie preparatu w płynie roboczym stosowanym do zaprawiania bulw. Według Katalogu Państwowego… (2020) stężenie fludioksonilu w płynie do zabiegów bulw ziemniaka wynosi od 500 do 1000 ppm, azoksystrobina (w płynie do obróbki dna bruzdy) - 3750-9375 ppm, difenokonazol (w płynie do zabiegów roślin wegetatywnych) - 187.5– 625 ppm.
Tabela 1. Podobieństwo sekwencji specyficznych dla gatunku sekwencji szczepów 18KSuPT2 i Ilyonectria crassa dostępnych w bazie danych Genbank
Szczep | Roślina żywicielska, miejsce wydalania | Numery sekwencji zdeponowane w GenBank, procent podobieństw | Połączenie | ||
JEGO | β-tubulina | TEF 1α | |||
17KSPT1 i 18KSuPT2 | Bulwa ziemniaka, region Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, ta praca |
CBS 158/31 | Korzenie narcyza, Holandia | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral i in., 2012 |
CBS 139/30 | Żarówka lilii, Holandia | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Korzeń żeń-szenia, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138. | Liść tulipana, Wielka Brytania | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Korzenie osiki, Kanada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield i in., 2020 |
ER1937 | Buk, Włochy | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Bezpośrednie poddanie się |
KAUF19 | Bulwa ziemniaka, Arabia Saudyjska | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = nie zdeponowano
Tabela 2. Odporność Ilyonectria crassa na fungicydy
(substancja aktywna) | EC50, ppm | ||||
3 dni | 5 dni | 7 dni | |||
Sterowanie | 17 ± 2 | 33 ± 5 | 47 ± 3 | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 ± 1 | 34 ± 2 | 48 ± 2 | ||
11 ± 1 | 11 ± 1 | 12 ± 1 | |||
11 ± 1 | 11 ± 1 | 12 ± 1 | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 ± 1 | 28 ± 2 | 48 ± 2 | ||
7 ± 1 | 13 ± 3 | 19 ± 4 | |||
5 ± 1 | 12 ± 1 | 17 ± 5 | |||
Skor, EC (difenokonazol) | 18 ± 1 | 35 ± 2 | 48 ± 1 | ||
11 ± 1 | 24 ± 3 | 35 ± 4 | |||
11 ± 1 | 13 ± 1 | 17 ± 3 |
W naszej pracy szczepy I. crassa wyizolowano z bulw ziemniaka w regionach Kostroma i Moskwa (Chudinova et al., 2019). Wysoki odsetek szczepów grzybów z sekwencjami ITS identycznymi z I. crassa ujawniono podczas analizy mikobioty bulw ziemniaka w Arabii Saudyjskiej (Gashgari i Gherbawy, 2013). Najwyraźniej I. crassa nie występuje na ziemniakach tak rzadko, jak mogłoby się wydawać. Nasze eksperymenty wykazały, że grzyb może infekować uszkodzone owoce pomidora. Z literatury wiadomo, że I. crassa jest zdolny do rozwoju saprotroficznego w glebie (Moll i in., 2016), a także do zakażania różnych roślin, nawet odległych taksonomicznie, takich jak żonkile, lilie, żeń-szeń, osika i buk (tab.1). jeden). Wygląda na to, że wiele roślin dzikich i ogrodowych może być rezerwatem I. crassa. Z powyższego wynika, że przy opracowywaniu środków ochronnych należy wziąć pod uwagę możliwość wpływania na bulwy ziemniaka tym grzybem. Szeroko rozpowszechnione preparaty do traktowania bulw ziemniaka zawierające fludioksonil, azoksystrobinę i difenokonazol wykazały wysoką skuteczność grzybobójczą przeciwko I. crassa.
Praca została wsparta przez Rosyjską Fundację Badań Podstawowych (grant nr 20-016-00139).
Artykuł został opublikowany w czasopiśmie "Biuletyn Ochrony Roślin", 2020, 103 (3)